姜黄醇对大鼠抑郁的改善作用及机制实验研究

李 玥,陈俊逾

(新疆医科大学第四临床医学院神志科,新疆 乌鲁木齐 830099)

抑郁症是自杀率较高的疾病,发病率逐年上升,男女比例高达1.7∶1[1]。目前,治疗抑郁症的药物根据不同作用机制分为选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(Selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)、5-羟色胺/去甲肾上腺素再摄取抑制剂(Serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor,SNRI)和三环类抗抑郁药(Tricyclic antidepressant,TCA)等,以上药物均是基于抑郁症单胺类递质紊乱假说,主要作用于抑郁患者脑内单胺类神经递质系统[2]。然而,多数药物在治疗过程中具有起效慢、效率低以及不良反应大等特点[3]。因此,需进一步探究抑郁症的病因及发病机制,为研制出起效快、特异性高且不良反应小的药物提供理论依据。铁死亡是程序性细胞死亡过程,与铁代谢紊乱密切相关[4]。已有研究[5]证实,铁死亡可能成为研究抑郁机制和抗抑郁药物的新靶点。在铁死亡过程中核受体共激活因子4(Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)起到关键作用,其下调可以抑制铁死亡诱导剂Erastin诱导的铁积累和脂质过氧化,以及随后铁死亡的发生[6]。姜黄醇又称莪术醇,是传统中药莪术、温郁金的有效活性成分,是一种具有生物活性的小分子倍半萜化合物[7]。研究[8]发现,姜黄醇通过调控NCOA4抑制铁蛋白吞噬,进而抑制非酒精性脂肪肝小鼠肝细胞衰老。研究[9]发现,温郁金对抑郁症的治疗起到积极作用。因此,本研究探究姜黄醇是否可以通过调控NCOA4介导的自噬调控铁死亡,进而起到抗抑郁的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠90只,7周龄,体重220～235 g,购自浙江维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(浙)2021-0006。饲养条件为温度(25±1)℃,湿度(65±5)%,光照-黑暗循环12 h。本研究经本院动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 姜黄醇(批号:HY-N0104)购自美国MCE公司;铁死亡诱导剂Erastin(批号:S80804)购自上海源叶生物有限公司;NCOA4、微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、LC3-Ⅱ、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、环氧合酶2(COX2)、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、环加氧酶2(PTGS2)抗体(批号:ab86707、ab245089、ab192890、ab125066、ab179800、ab155282、ab283574)购自Abcam公司;铁含量测定试剂盒(批号:K390-100)购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模型构建:采用Erastin诱导大鼠急性抑郁模型。用99.9%异氟醚麻醉大鼠后,将头部放置在立体定位装置中,颅骨暴露在外。在左、右半球分别钻出小孔,以便给药。插入一根26规格不锈钢针(坐标:颅骨下3.5 mm,前囟后4.8 mm,中缝左、右2.5 mm)并连接Hamilton注射器。注射2.5 μl浓度为200 ng/μl的Erastin,将针头放置5 min,使药物扩散。另一半球重复上述操作。

1.3.2 分组及处理:根据随机数字表法将大鼠分为假手术组、Erastin组、姜黄醇组、姜黄醇+pcDNA-NC组、姜黄醇+pcDNA-NCOA4组,每组18只。假手术组在模型构建时只放置针头,不注射药物。姜黄醇组腹腔注射姜黄醇10 mg/kg,每天1次,连续2周[10]。姜黄醇+pcDNA-NC组在腹腔注射10 mg/kg姜黄醇的基础上通过尾静脉注射pcDNA-NC,每周2次,注射2周,共4次。姜黄醇+pcDNA-NCOA4组在腹腔注射10 mg/kg姜黄醇的基础上尾静脉注射pcDNA-NCOA4,每周2次,注射2周,共4次。假手术组和Erastin组分别给予等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射(每天1次,连续2周)和尾静脉注射(每周2次,注射2周,共4次)。

1.3.3 动物行为学评价

1.3.3.1 糖水偏好实验(SPT):实验前剥夺大鼠食物和水24 h。将每只大鼠单独放在笼子里,分别放置一瓶水和一瓶1%蔗糖溶液。让其自由饮水12 h,记录蔗糖溶液和水的消耗量。蔗糖水偏好(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。

1.3.3.2 旷场实验(OFT):使用ANYmaze软件中开放野外功能对大鼠进行监测。在软件中,立方体开箱长度和宽度均50 cm,平均分为25个正方形,中间9个为中心区域,大鼠为监测点。将每只大鼠放入盒子后,记录中心区域移动距离、静止时间和5 min内交叉次数。每只老鼠完成测试后,用75%乙醇喷洒箱子并擦拭,避免气味干扰。

1.3.3.3 悬尾实验(TST):固定大鼠尾部使其头部朝下,头部距地面50 cm,记录大鼠4 min内的静止时间。

1.3.3.4 强迫游泳实验(FST):实验前给予5 d适应性训练。训练结束24 h后将大鼠放入高40 cm、直径28 cm、水深30 cm的玻璃容器中,水温25 ℃左右。总游泳时间为6 min,记录最后4 min大鼠的静止时间。

1.3.4 线粒体形态观察:每组取6只大鼠,麻醉并处死,将大鼠海马组织(1 mm×1 mm×1 mm)用2.5%戊二醛在4 ℃下固定过夜。用磷酸缓冲液冲洗3次,经梯度乙醇脱水,然后包埋、切片,切片厚度为60～80 nm,通过透射电子显微镜观察线粒体形态。

1.3.5 铁含量测定:每组取6只大鼠,麻醉并处死,采用微波消化法对海马组织样品进行预处理,然后通过铁含量测定试剂盒测定铁含量。采用Multiskan GO检测系统在波长593 nm处检测平均光密度,根据标准曲线计算总铁和亚铁含量。

1.3.6 自噬以及铁死亡相关蛋白检测:将各组剩余6只大鼠海马组织加入RIPA蛋白裂解液提取总蛋白,通过BCA法检测蛋白质浓度。各组取20 μg总蛋白质,蛋白质样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶封闭膜2 h。加入自噬蛋白(NCOA4、LC3)、铁死亡相关蛋白(GPX4、COX2、ACSL4、PTGS2)抗体在4 ℃孵育过夜,加入二抗室温孵育2 h。加入ECL试剂显色,采用Image J软件分析目标蛋白的灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学指标比较 见表1。与假手术组比较,Erastin组大鼠蔗糖水偏好、OFT中心区移动距离、OFT交叉次数降低,FST静止时间、TST静止时间、OFT静止时间升高(均P<0.05)。与Erastin组比较,姜黄醇组蔗糖水偏好、OFT中心区移动距离、OFT交叉次数升高,FST静止时间、TST静止时间、OFT静止时间降低(均P<0.05)。与姜黄醇组、姜黄醇+pcDNA-NC组比较,姜黄醇+pcDNA-NCOA4组蔗糖水偏好、OFT中心区移动距离、OFT交叉次数降低,FST静止时间、TST静止时间、OFT静止时间升高(均P<0.05)。

表1 各组大鼠行为学指标比较

2.2 各组大鼠海马组织线粒体形态比较 见图1。假手术组海马组织线粒体结构正常。与假手术组比较,Erastin组线粒体肿胀,线粒体嵴丢失。与Erastin组比较,姜黄醇组线粒体肿胀、线粒体嵴丢失现象改善,线粒体结构与假手术组相似;姜黄醇+pcDNA-NCOA4组与Erastin组海马组织线粒体损伤现象相似。

图1 各组大鼠海马组织透射电镜下线粒体形态(×15000)

2.3 各组大鼠海马组织总铁和亚铁含量比较 见表2。Erastin组大鼠总铁及亚铁含量较假手术组升高(均P<0.05)。姜黄醇组总铁及亚铁含量较Erastin 组降低(均P<0.05)。姜黄醇+pcDNA-NCOA4组总铁及亚铁含量较姜黄醇组、姜黄醇+pcDNA-NC组升高(均P<0.05)。

表2 各组大鼠海马组织总铁和亚铁含量比较(μg/mg)

2.4 各组大鼠海马组织自噬蛋白及铁死亡相关蛋白表达水平比较 见表3。与假手术组比较,Erastin 组NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表达水平升高,GPX4蛋白表达水平降低(均P<0.05)。与Erastin组比较,姜黄醇组GPX4蛋白表达水平升高,NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表达水平降低(均P<0.05)。与姜黄醇组、姜黄醇+pcDNA-NC组比较,姜黄醇+pcDNA-NCOA4组NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表达水平升高,GPX4蛋白表达水平降低(均P<0.05)。

表3 各组大鼠海马组织自噬蛋白及铁死亡相关蛋白表达水平比较

3 讨 论

抑郁症是一种常见的慢性精神障碍性疾病,影响着全球超过3.5亿人[11-13]。2008年,世界卫生组织将抑郁症列为全球疾病负担的第三大因素[1]。到目前为止,相当多的抑郁症患者对一线抗抑郁治疗反应不佳,或出现不良反应,导致治疗中断或复发[14-15]。因此,需要寻找新的药物来提高疗效。

姜黄醇是一种天然化合物,大量研究[16-17]发现姜黄醇具有抗炎、抗氧化等药理作用,在癌症等多种疾病中发挥积极效果。姜黄醇可通过抑制神经元兴奋性来抑制癫痫的疾病进展,抑郁症和癫痫同属于神经系统性疾病,故姜黄醇可能成为治疗抑郁症的潜在药物[18]。本文的创新点在于首次探究了姜黄醇对抑郁症的改善作用和具体作用机制。本研究发现,抑郁症大鼠蔗糖水偏好、中心区移动距离、交叉次数显著下降,FST静止时间、TST静止时间、OFT静止时间显著升高,提示Erastin诱导抑郁症大鼠造模成功,而经姜黄醇处理后,大鼠蔗糖水偏好、中心区移动距离、交叉次数显著升高,FST静止时间、TST静止时间、OFT静止时间显著下降,提示姜黄醇对大鼠抑郁症起到改善作用。

铁自噬是一种新型的自噬,铁蛋白通过自噬溶酶体途径降解释放铁到细胞质中,在调节铁稳态中发挥重要作用[19]。越来越多的证据表明,铁自噬参与了神经系统疾病的发病机制,包括阿尔茨海默病、帕金森病和抑郁症[20]。NCOA4是一种普遍表达的细胞内蛋白,介导铁蛋白(细胞铁储存复合物)的自噬降解,对于维持全身铁平衡至关重要[21]。据报道,敲低NCOA4基因降低了铁蛋白的降解,同时导致了铁代谢紊乱。本研究通过检测自噬标志因子发现,姜黄醇处理后抑郁症大鼠NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平、总铁及亚铁含量显著降低,提示姜黄醇可能通过抑制NCOA4介导的铁自噬对大鼠抑郁症起到改善作用。

有研究[22]报道,自噬通过铁蛋白和转铁蛋白受体调节细胞内铁水平和铁死亡。铁死亡是一种依赖于铁离子的非凋亡程序性细胞死亡模式。NCOA4使细胞内的铁蛋白转移至自噬溶酶体中并释放游离铁,在多种铁依赖的生理过程中发挥作用。当铁自噬过度激活时,细胞内的铁过量沉积,诱导谷胱甘肽耗尽和GPX4表达降低,进而导致细胞膜结构破裂,最终引起细胞铁死亡[23]。铁死亡的发生与PTGS2的增加有关。PTGS2编码的COX2基因在铁死亡诱导剂的作用下显著表达[24-25]。GPX4是一种硒蛋白,用于修复哺乳动物脂质细胞的氧化损伤,可以通过抑制铁依赖性脂质过氧化防止铁死亡的发展。增加GPX4蛋白水平,降低COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平可以抑制铁死亡,改善暴露于氧葡萄糖剥夺/复氧的神经元损伤[26]。JIAO等[5]发现,抑郁症大鼠COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平显著升高,而GPX4蛋白水平显著下降,与本研究结果一致。本研究发现姜黄醇处理后线粒体肿胀,线粒体嵴丢失现象改善,COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平显著降低,GPX4蛋白水平显著升高,提示姜黄醇可能通过抑制NCOA4介导的铁自噬进而抑制铁死亡,对大鼠抑郁症起到改善作用。有研究[27]发现,姜黄醇通过促进NCOA4介导的铁自噬诱导铁死亡,进而起到抗纤维化的作用,与本文的结果相反,这可能是由于疾病类型不同导致的。为进一步证实,本研究过表达NCOA4后结果显示,NCOA4消除了姜黄醇对抑郁症大鼠的有利影响。

综上所述,姜黄醇可能通过抑制NCOA4介导的铁自噬抑制铁死亡,对抑郁症起到治疗效果。