多次吸入七氟醚对幼鼠学习记忆的影响实验研究

陈雅慧,马芬芬,田艺苑,邓智中,兰忠平

(延安大学医学院,陕西 延安 716000)

七氟醚是常用吸入麻醉药,具有潜在神经元毒性作用,会导致认知功能障碍。有研究[1]发现,七氟醚可诱导新生大鼠神经元树突棘发育异常,使大鼠发生认知障碍。有研究[2-5]发现,七氟醚可使肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素(Interleukin,IL)-1β过度表达而损伤神经元,其损伤神经元的机制与诱导皮质神经元发生铁死亡有关。然而,七氟醚对发育期大鼠学习记忆功能的影响是否与吸入时间、次数相关,目前研究报道较少。因此,本研究针对这一问题进行实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠40只,雌雄各半,3周龄,体重45～55 g,由西安交通大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(陕)2022-010。

1.2 主要试剂 吸入七氟醚(国药准字H20070172)购自上海恒瑞医药有限公司;乙酰胆碱酯酶(AchE)检测试剂盒(批号: 20220515)和一氧化氮合酶(NOS)检测试剂盒(批号: 20220837) 购自南京建成生物工程研究所;半胱氨酸蛋白酶-3(Capase-3)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)试剂购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不同时长七氟醚麻醉幼鼠模型制备:将SD幼鼠分为四组,每组10只。A组不吸入七氟醚;B组吸入3%七氟醚2 h;C组吸入3%七氟醚2 h,每周1次,共2次;D组吸入3%七氟醚2 h,每周1次,共3次。除A组外,将其余各组幼鼠置于麻醉箱中,自制透明麻醉箱上方接口与动物呼吸麻醉机通气孔相连通,箱内通入3%七氟醚和30%氧气(氧气流量为3 L/min)混合气体。麻醉期间仔细观察幼鼠状态如肢端皮肤和黏膜颜色。麻醉结束后打开麻醉箱,待幼鼠自然清醒后放回饲养笼中,其余时间正常饲养。

1.3.2 Morris水迷宫实验:各组大鼠饲养至42日龄后,进行连续6 d的Morris水迷宫实验。前5 d进行水迷宫定位航行实验,第6天进行空间探索实验。①水迷宫定位航行实验:将平台隐蔽水下2 cm,水中加入牛奶,掩盖平台分别从四个象限固定点。将大鼠放入水中,设定120 s,记录大鼠找到平台所需时间(潜伏期)。如果大鼠失败,则将其引导至平台,停留10～15 s,潜伏期记录为120 s。将每天4次获得的潜伏期求取平均值,所得数值即为大鼠当天的潜伏期。②空间探索实验:让大鼠从四个象限固定点入水,记录大鼠平台所在区域有效穿梭次数和停留时间,然后求取平均值。

1.3.3 海马组织NOS含量和AchE活性测定:水迷宫空间探索实验后, 1%戊巴比妥钠麻醉49日龄大鼠后,迅速打开胸腔,暴露心脏,从右心室主动脉灌流PBS以去除脑组织中的血液,直至大鼠通体变白。冰盘上快速分离出海马组织,称重分装后投入无RNA酶的1.5 ml EP管中,迅速放入液氮速冻和-80 ℃保存备用。加入预冷的0.9%氯化钠溶液,用匀浆器按1∶9的比例制成10%组织匀浆,于4 ℃下3000 r/min离心10 min,提取上清液-20 ℃冻存待测。采用比色法检测AchE活性和NOS含量。

1.3.4 海马组织中凋亡蛋白水平检测:取海马组织约300 mg放入液氮预冷研钵中,加入含1%蛋白酶抑制剂RIPA裂解液2 ml,添加液氮并迅速研磨,此过程中不断加入液氮以防止蛋白降解。将研磨液转移至预冷离心管中,于冰盒中裂解20 min,4 ℃下12000 r/min离心30 min,吸取上清液后冻存于-80 ℃。收集蛋白上清于新的EP管中,加入上样缓冲液,98 ℃变性10 min。BCA定量,电泳后转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭1 h,孵育一抗,4 ℃过夜。TBST洗膜10 min×3次,室温摇床孵育二抗1 h。TBST洗膜10 min×3次,化学发光显色并使用Image J进行灰度值分析,计算Caspase-3和 Bcl-2蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠定位航行实验潜伏期比较 见表1。第1天,各组大鼠寻找平台的潜伏期比较差异无统计学意义(P>0.05) 。从第2天开始,B、C、D组潜伏期较A组明显延长(均P<0.05)。在第3、4、5天,D组潜伏期较B组和C组明显延长(均P<0.05)。

2.2 各组大鼠空间探索实验穿越平台次数和停留时间比较 见表2。在空间搜索实验中,B、C、D组穿越平台次数和停留时间与A组比较明显减少(均P<0.05) 。D组与B、C组比较,穿越平台次数和停留时间减少(均P<0.05)。

表2 各组大鼠空间探索实验穿越平台次数和停留时间比较

2.3 各组大鼠海马组织NOS含量和AchE活性比较 见表3。B、C、D组大鼠海马组织NOS含量低于A组,且C、D组低于B组,D组低于C组(均P<0.05)。B、C、D组大鼠海马组织AChE活性高于A组,且C、D组高于B组,D组高于C组(均P<0.05)。

表3 各组大鼠海马组织NOS含量和AchE活性比较

2.4 各组大鼠海马组织Capase-3和Bcl-2蛋白表达比较 见图1。B、C、D组大鼠海马组织Capase-3蛋白高于A组,且C、D组高于B组,D组高于C组(均P<0.05)。C、D组大鼠海马组织Bcl-2蛋白低于A、B组,且D组低于C组(均P<0.05)。

注:左图为Capase-3和Bcl-2蛋白电泳图。柱状图为各组大鼠海马组织Capase-3和Bcl-2蛋白表达比较,与A组比较,*P<0.05;与B组比较,#P<0.05;与C组比较,&P<0.05图1 各组大鼠海马组织Capase-3和Bcl-2蛋白表达比较

3 讨 论

认知是机体对获取信息的加工过程,学习记忆是其重要的环节。七氟醚是一种临床上儿科常用挥发性麻醉药,吸入七氟醚对儿童远期认知的影响目前研究尚无清晰的定论。幼儿时期吸入七氟醚对认知功能的影响可能是多方面的。本研究探索在幼儿期增加吸入七氟醚次数对幼鼠学习记忆的影响。Morris水迷宫实验可以反映动物的认知功能、空间学习和记忆能力,也是常用的研究学习记忆的手段。Morris水迷宫实验包括定位航行实验和空间搜索实验。定位航行实验中的潜伏期反映大鼠学习成绩,空间搜索实验中大鼠穿越原平台象限的次数反映大鼠的记忆保存能力。既往研究[6]发现,七氟醚可诱导幼年小鼠神经元凋亡,损伤其学习与记忆能力。晋菲菲等[7]研究发现,幼年动物在吸入性麻醉剂七氟醚中暴露时间越长,脑神经细胞死亡数越多,动物后来的学习记忆及行为发育越迟缓。

本实验发现,幼鼠吸入七氟醚次数越多,幼鼠找到平台的时间越长,吸入七氟醚的幼鼠找到平台的潜伏期比对照组明显延长,空间搜索实验中吸入七氟醚的幼鼠穿越平台次数减少,说明幼鼠吸入七氟醚次数越多,学习记忆能力越差。以往研究[8]发现,幼年小鼠连续3 d每天用七氟醚麻醉2 h,其空间记忆能力受损,Morris水迷宫实验中学习记忆能力较差,本研究结果与之基本一致。

学习记忆的维持与脑神经突触可塑性密切相关,而突触可塑性与脑内神经递质的变化有关。脑内递质一氧化氮(NO)和乙酰胆碱(Ach)是进行及维持高级神经系统功能的重要介质。Ach水平与学习记忆的增强呈量效关系。研究[9]发现,七氟醚可导致基底前脑AchE的表达及酶活性下降,从而导致脑内Ach合成减少,最终导致幼鼠认知功能损害。学习记忆相关的长时程增强(LTP)的形成和建立离不开NO的参与。NOS是合成NO的关键酶,当NOS缺乏时NO生成不足,必将影响LTP的形成和突触可塑性的建立,进而影响正常学习记忆行为。本研究发现,吸入七氟醚后大鼠脑内NOS含量降低,AchE活性增加。也有研究[10]认为,脑源性神经营养因子(BDNF)是大脑发育中影响突触可塑性的主要分子介质,七氟醚能通过降低BDNF水平及其受体酪氨酸激酶B的磷酸化来抑制BDNF酪氨酸激酶B信号转导,降低突触密度,导致突触超微结构发生改变,LTP减少,从而损害认知功能。SHEN等[11]研究发现,LTP减少还可能与突触蛋白的异常表达有关,反复接触七氟醚的大鼠海马突触后致密区G蛋白受体和谷氨酸受体1表达水平降低,导致突触结构被破坏,LTP减少。

研究[12-16]发现,将幼龄动物重复多次或者长时间进行全麻药物的暴露可以使大脑组织中凋亡蛋白 Bax-2和Caspase-3增加,使神经细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2含量减少,从而促进神经细胞发生凋亡。PENG等[17]研究发现,暴露于七氟醚6 h会显著增加Caspase-3和Bax蛋白的表达,从而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 表达,加速程序性细胞死亡。同样,LEI等[18]将出生7 d的SD大鼠暴露于3%七氟醚6 h,发现幼鼠顶叶皮质Caspase-3蛋白表达增加,海马DG区神经元祖细胞活性明显降低,而水迷宫实验发现七氟醚组潜伏期明显长于对照组。研究[8]发现,幼鼠经七氟醚暴露后4周,学习和记忆出现障碍,海马神经元干细胞凋亡数量增加。陈勇等[19]研究发现,大鼠吸入七氟醚浓度的增加会降低海马去甲肾上腺素、5-羟色胺水平,增强对三磷酸腺苷受体P2X3表达的抑制作用,增加海马区细胞凋亡,降低大鼠记忆行为能力。张晚来等[20]研究发现,七氟醚可以通过miR-21-5p/RTN4轴促进大鼠神经干细胞凋亡和抑制其增殖。本研究结果显示,D组Caspase-3蛋白高于A组,Bcl-2蛋白低于A组,说明幼鼠吸入七氟醚次数越多,海马中神经元凋亡越多,神经损伤越大。

为减轻七氟醚对神经元凋亡的影响,大多研究主要集中于联合用药。唐心愿[21]在探讨七氟醚麻醉对小鼠神经元的兴奋性作用及其对神经元凋亡的影响时发现,右美托咪定可以增强七氟醚的麻醉镇静效果,降低小鼠活动性,降低神经元蛋白C-Fos表达,减少细胞凋亡,减少小鼠脑皮质内磷酸化Tau蛋白含量。高荣等[22]研究认为,孕酮对孕中期吸入七氟醚致子鼠神经损伤的改善作用可能与其抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化介导的海马细胞凋亡率上升和突触相关蛋白表达水平下降有关。李珍等[23]研究发现,miR-124可以使海马组织中BDNF、PI3K、AKT2蛋白表达升高,减少海马神经元细胞凋亡。熊璐等[24]研究发现,神经生长因子(NGF)可减轻七氟醚诱导的基底前脑胆碱能系统退变及认知障碍。张力召等[25]研究发现,婴幼儿磁共振成像检查时七氟醚吸入麻醉联合右美托咪定滴鼻可增强镇静效果,安全性更高。

综上所述,吸入七氟醚次数增加会损伤新生幼鼠的学习记忆能力,临床上应尽量减少七氟醚的使用次数,并联合其他措施尽可能降低七氟醚对学习记忆能力的影响。