新疆阿克苏地区鸭源鸡杆菌的分离鉴定和生物学特性分析

郝 斌,张家浩,黎 双,李雪娇,陈 鑫,刘淑华,梁樊鑫,侯梦哲,李莲瑞

(1. 塔里木大学动物科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300;2. 塔里木畜牧科技兵团重点实验室,新疆 阿拉尔 843300;3. 新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室,新疆 阿拉尔 843300)

鸭源鸡杆菌(Gallibacteriumanatis,G.anatis)属于巴氏杆菌科、鸡杆菌属[1-2],是一种条件性致病菌,其致病潜力高度可变[3],且不同菌株的致病力存在较大差异。该菌主要影响禽类的生殖器官和呼吸道,常引起鸡输卵管囊肿等生殖道疾病[4],可导致蛋鸡产蛋量出现断崖式下跌,并引起蛋品质下降,严重可造成鸡只死亡,给养鸡业的健康发展造成了极大的安全隐患,对欧洲、亚洲等家禽产业的生产力产生了严重影响[5]。G.anatis可感染多种宿主,不仅能感染禽类,而且可感染猪、牛、羊等动物和人类[6-7]。

G.anatis最早由Kjos-Hansen于1950年报道[8],而后世界范围内相继报道了G.anatis的发生和感染[9-10]。我国对G.anatis的研究报道较晚,最早是由王川庆等[11]于2008年通过对国内12个鸡场G.anatis进行抗体检测,发现所检鸡场均有G.anatis感染,平均阳性率为48.4%,表明我国鸡群中普遍存在G.anatis感染。2003年,Bojesen等[12]在不同鸡群的健康鸡中检测出G.anatis;2009年,国内郑鹿平等[13]从河南地区健康鸡群中分离得到G.anatis,提示该菌对健康鸡群有潜在的威胁。郑鹿平[14]和李乔晶[15]通过SPF鸡同居感染试验发现,健康鸡只与感染G.anatis鸡只同居后2 d,即可从上腭裂和泄殖腔分离出G.anatis,并可长期、持续带菌和排菌。

G.anatis可引起家禽输卵管炎和卵巢炎等疾病,是影响养禽业的一种重要病原菌。目前,国内对G.anatis耐药状况的报道较少,临床用药缺乏可靠的理论依据和参考标准。2007年,王川庆等首次对60株G.anatis进行药敏试验,分离菌仅对头孢类、阿莫西林、氨苄西林和氟苯尼考等药物高度敏感,而对其余大多数抗菌药物均不敏感[11]。而后我国多地都相继出现G.anatis耐药性的报道,郑鹿平等[13-14]、李乔晶[15]、方翟等[16]、陈国权等[17]和唐诗等[18]的研究均表明,G.anatis分离菌株普遍存在多重耐药现象。

新疆维吾尔自治区阿克苏地区某鸡场120日龄开产蛋鸡出现精神沉郁、腹部隆突、喜卧、厌食、嗜睡和行走步态不稳等症状,部分鸡只存在病死情况。剖检病死鸡可见输卵管炎和腹膜炎等症状,怀疑G.anatis感染。目前,新疆地区G.anatis感染和耐药性的报道尚不多见。本试验从病死鸡的内脏中分离和鉴定G.anatis,并对其病原学和耐药性进行分析,为G.anatis感染的诊断和防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源 随机选取2只症状明显的病鸡,无菌采集其内脏,放于-4 ℃保存。

1.2 试验动物 10只23周龄健康海兰褐蛋鸡和15只1日龄SPF级BWEL雏鸡,均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物实验中心[许可证编号:SCXK(黑)2017—005],身体健康,表现出较强的活力,采集每只鸡的泄殖腔拭子和咽拭子样本进行细菌分离,所有试验鸡只G.anatis检测均为阴性。

1.3 主要试剂 革兰染液、生化反应管、药敏纸片和Mueller-Hinton(MH)培养基,均购自杭州天和微生物试剂有限公司;DNA Marker,购自TaKaRa公司;绵羊血琼脂固体培养基、Brain Heart Infusion(BHI)固体培养基和Brain Heart Infusion(BHI)液体培养基,均购自青岛海博生物技术有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 主要仪器 凝胶成像仪,购自美国Bio-RAD公司;PCR仪,购自英国TECHNE公司;加热制冷循环器,购自德国JULABO Labortechnik Gmbh公司;稳压稳流电泳仪,购自北京市六一仪器厂;核酸蛋白检测仪,购自美国丹诺尔Denovix公司。

1.5 试验方法

1.5.1 细菌的分离和纯化 无菌采集病鸡的肝脏、肺脏和输卵管等病变组织,划线接种于绵羊血琼脂固体培养基和BHI固体培养基进行纯化培养,37 ℃培养24 h后,选取单一形态的单菌落进行革兰染色和镜检。

1.5.2 分离菌株的生化鉴定 选取硫化氢、葡萄糖等生化反应管,按照说明书对分离菌株进行生化鉴定。

1.5.3 分离菌株的PCR检测 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取分离菌株的DNA,经核酸蛋白检测仪检测OD260 nm/280 nm以判定提取的DNA是否合格。参照参考文献[19]合成细菌16S rRNA基因通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。预期扩增产物长度约为1 400 bp。PCR扩增体系:DNA模板1 μL,EasyTaqSuperMix 12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 0.5 min,56 ℃ 0.5 min,72 ℃ 1.5 min,共35个循环;72 ℃ 10 min。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

1.5.4 分离菌株16S rRNA序列比对和系统进化树分析 将测序获得的分离菌株完整序列在NCBI中GenBank数据库进行序列比对[20],采用DNASTAR软件绘制系统进化树。

1.5.5 分离菌株的药物敏感性试验 根据KB纸片法,将适量菌液涂布于MH培养基,再将药敏纸片贴于培养基上,37 ℃培养24 h后,测量17种抗菌药物的抑菌圈直径,根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的标准判定结果。

1.5.6 动物回归试验 试验前使用高锰酸钾对恒温室进行消毒处理[21],将所有试验鸡只在恒温室饲养7 d适应环境。将分离菌株的单菌落接种于BHI液体培养基,使其浓度达到3×108CFU/mL,再用PBS将分离菌株原菌液依次稀释至3×107和3×106CFU/mL。

1.5.6.1 海兰褐蛋鸡回归试验 给予所有海兰褐蛋鸡相同的生活环境、食物和水源,适应饲养7 d后,将海兰褐蛋鸡(编号为1～10)随机分为2个组。编号1～5为试验组,分别经生殖道接种0.2 mL浓度为3×108CFU/mL的菌液;编号6～10为对照组,分别经生殖道接种0.2 mL的0.9%生理盐水(表1)。每日早、晚观察对照组和试验组海兰褐蛋鸡的临床表现,连续观察10 d。每日采集对照组和试验组海兰褐蛋鸡泄殖腔拭子和咽拭子样本进行细菌分离,对照组海兰褐蛋鸡隔离饲养。试验结束后将所有海兰褐蛋鸡剖检。

表1 试验设计

1.5.6.2 雏鸡回归试验 给予所有雏鸡相同的生活环境、食物和水源,适应饲养7 d后,将雏鸡(编号为1～15)随机分为2个组。编号1～3、4～6和7～9分别为试验组1、试验组2和试验组3,分别经腹腔接种0.2 mL浓度为3×106、3×107和3×108CFU/mL的菌液;编号10～12和13～15分别为同居组和对照组,分别经腹腔接种0.2 mL的0.9%生理盐水(表1)。每日早、晚观察试验组、同居组和对照组雏鸡的临床表现,连续观察10 d。每日采集对照组和试验组雏鸡泄殖腔拭子和咽拭子样本进行细菌分离,从试验组分离出G.anatis后将试验组雏鸡与同居组雏鸡混合饲养,每日对同居组雏鸡同上进行细菌分离[15],对照组雏鸡隔离饲养。试验结束后将所有雏鸡剖检。

2 结果

2.1 细菌的分离和纯化 分离菌株在BHI固体培养基培养24 h后,呈圆形的乳白色菌落;在绵羊血琼脂固体培养基上呈半透明、圆形、灰白色、β溶血的小菌落。分离菌株革兰染色呈阴性,为两端钝圆、单个或成对分布的杆状菌(图1)。

图1 分离菌株的革兰染色镜检(1 000×)

2.2 分离菌株的生化鉴定 结果见表2,参照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)[22],该分离菌株生化特性与G.anatis相符。

表2 分离菌株的生化鉴定

2.3 分离菌株的PCR检测 提取分离菌株的DNA,经检测OD260 nm/280 nm值均为1.8～2.0,经16S rRNA基因PCR扩增,可扩增约为1 400 bp的目的条带(图2)。

图2 分离菌株16S rRNA的PCR扩增

2.4 分离菌株16S rRNA序列比对和系统进化树分析 分离菌株与GenBank中收录的G.anatis同源性最高,均在99.4%以上,处于同一进化分支(图3)。综合判定分离菌株为G.anatis,将其命名为HZ-PJS2022。

图3 基于分离菌株16S rRNA构建的系统进化树

2.5 分离菌株的药物敏感性试验 结果如表3所示,分离菌株对红霉素、苯唑西林、复方新诺明、米诺环素、磺胺甲噁唑、多西环素、四环素、氯霉素、克林霉素和环丙沙星耐药;对庆大霉素、新霉素和丁胺卡那霉素中度敏感;对氨苄西林、头孢呱酮、头孢吡肟和恩诺沙星敏感。

表3 分离菌株的药物敏感性试验

2.6 动物回归试验

2.6.1 海兰褐蛋鸡回归试验 试验组海兰褐蛋鸡于感染后第2天均表现精神萎靡、采食量下降;感染后第7天,采食量进一步下降,出现缩头闭眼、嗜睡症状,个别海兰褐蛋鸡生殖道外翻困难、拉黄色泡沫样稀粪。试验结束后剖检所有海兰褐蛋鸡,结果显示,试验组海兰褐蛋鸡均出现程度不一的生殖系统病变,卵泡充血、变形和液化,破裂后卵黄跌入腹腔形成腹膜炎,输卵管发炎、囊肿、积液、内有白色干酪物和炎性分泌物(图4A和4B),与发病鸡场病鸡的剖检变化一致,其他脏器无异常;对照组海兰褐蛋鸡均无异常。采集试验组海兰褐蛋鸡的肝脏、卵泡和输卵管进行细菌分离和纯化,与原分离菌株的菌落形态和革兰染色特征相同(图4C)。攻菌后试验组海兰褐蛋鸡日产蛋率在100%～60%波动,第6、7 天产蛋率最低,并维持在60%;产蛋中后期个别海兰褐蛋鸡所产鸡蛋的蛋壳质量差,皮薄且易碎。

图4 分离菌株的动物回归试验

2.6.2 雏鸡回归试验 雏鸡感染后12 h,试验组1雏鸡缩颈闭目、精神萎靡、呆立,对外界刺激有反应;试验组2和试验组3雏鸡站立不稳、食欲废绝、对外界刺激不敏感;感染后24 h,试验组2和试验组3雏鸡全部死亡,试验组1雏鸡蹲伏嗜睡、缩颈闭目、羽毛蓬松且零乱;而后雏鸡上述症状逐渐恢复,至试验结束无死亡。对死亡雏鸡剖检,可见肝脏、脾脏、腺胃、肌胃和肠道黏膜出血,输尿管尿酸盐沉积等病理变化(图4D)。采集死亡雏鸡的肝脏、卵泡和输卵管进行细菌分离和培养,可再次分离出G.anatis。试验组2和试验组3在人工感染后第2天从上颚裂分离出G.anatis,同居组和试验组1分别在同居第2天和人工感染后第4天从上颚裂分离出G.anatis。在整个试验过程中,对照组雏鸡均未分离出G.anatis。

3 讨论

自1950年G.anatis被Kjos-Hansen[7]首次分离报道至今,NCBI中GenBank数据库仅收录30余株G.anatis的全基因组序列。目前,国内对G.anatis的研究报道较少,本试验结果表明,新疆维吾尔自治区鸡群存在G.anatis感染。

G.anatis是一种机会致病菌,常与禽肺病毒、鸡毒支原体等病原混合感染[23],并可导致感染加剧。Christensen等[24]报道显示,在对G.anatis进行分离和纯化时,经常会受到大肠杆菌等其他细菌的影响。该菌培养条件较苛刻,在普通琼脂、麦康凯、伊红美兰、三糖铁和SS等培养基上均不生长,在LB液体培养基中生长不良,在绵羊血琼脂和BHI固体培养基上生长良好。而大肠杆菌等其他细菌相较于G.anatis,在分离培养细菌时具有明显的生长优势,因此容易覆盖G.anatis。另外,G.anatis形成的菌落较小,往往容易被忽视,从而降低了其分离率,这可能是G.anatis没有引起足够重视的原因之一。另一原因是G.anatis导致的输卵管炎和腹膜炎等症状,常被误认为由其他原因引起,如霉菌毒素、衣原体感染和玉米赤霉烯酮等[25]。

G.anatis通常存在于输卵管、气管、肠道和泄殖腔中,以水平传播为主[26]。郑鹿平[14]和李乔晶[15]的研究结果证明,健康鸡只与感染G.anatis鸡只同居后2 d,即可从上腭裂和泄殖腔分离出G.anatis,并可长期、持续带菌和排菌,与本试验结果一致。有研究报道显示,从感染G.anatis的病鸡所产蛋中能够分离到G.anatis[20,27],说明该菌还可以垂直传播,这对养禽业影响很大。而目前养鸡生产主要以笼养为主,这就意味着鸡舍中一旦存在G.anatis,全群都有被感染的风险。Bojesen等[27]研究表明,鸡隐性感染G.anatis时,其主要存在于鸡的上呼吸道,生殖系统几乎不存在。若鸡因应激等原因导致抵抗力下降时,该菌则可入侵生殖系统,引起严重的生殖障碍疾病。故加强对未开产蛋鸡体内G.anatis的检测,做好饲养管理和生物安全措施,对降低G.anatis感染和提高养殖经济效益具有重要意义。

G.anatis的血清型众多,且各血清型之间无交叉免疫保护作用,加上其具有多重耐药性,感染率高而发病率低,病例的发生无规律可循[28],导致对该菌感染的防治十分棘手。本试验中G.anatis分离菌株存在多重耐药性,在以往的研究中也有类似的结果[13-18]。药敏试验结果显示,分离菌株HZ-PJS2022对红霉素、苯唑西林、复方新诺明、米诺环素、磺胺甲噁唑、多西环素、四环素、氯霉素、克林霉素和环丙沙星耐药;对氨苄西林、头孢呱酮、头孢吡肟和恩诺沙星敏感。结合以往研究可知,我国G.anatis已对常用的多种抗菌药物产生了广泛的耐药性。海兰褐蛋鸡回归试验和雏鸡回归试验结果显示,该分离菌株可在鸡体内存活,引起蛋鸡生殖系统疾病,造成产蛋率下降,并有较强的致病性。

综上所述,本试验从新疆维吾尔自治区阿克苏地区某鸡场病鸡内脏中分离出1株G.anatis,药敏试验表明分离菌株具有多重耐药性,可以使用氨苄西林、头孢呱酮、头孢吡肟和恩诺沙星进行治疗。