抗菌肽对鱼类肠道菌群及免疫功能影响的研究进展

■ 董晓庆 姜 丹 曲桂娟 陈玉珂 王桂芹*

（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118；3.吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林长春 130118）

我国是水产养殖大国，2021年全国水产养殖产量已达到5 394.41 万吨，其中鱼类养殖占比达52.36%。快速发展的水产养殖业也带来一系列的问题，如超负荷养殖，违规使用抗生素等。抗生素滥用已造成严重的环境污染，影响食品安全，威胁到人类的健康。因此，抗生素替代研究逐渐成为新的研究热点。近年来，植物提取物[1-2]、有机化合物[3]和抗菌肽（AMPs）[4]等饲料添加剂被证明对鱼类生长和免疫有增强作用。抗菌肽是一种小分子多肽，在动物体内不易产生耐药性、不易残留。作为饲料添加剂，抗菌肽能改善动物机体的生长性能和健康状态，如促进动物生长，改善肠道形态[5]；调节动物肠道微生物区系，增强动物机体免疫力等[6-7]。

肠道是一个复杂的微生态系统，肠道菌群与动物机体的营养、代谢、免疫密切相关。鱼类的主要消化系统是肠道，肠道健康状况和微生物种群是影响鱼类养殖的关键因素。鱼类肠道菌群与机体的新陈代谢有关[8]。鱼类处于健康时，其肠道菌群会保持一定的动态平衡[9]。健康鱼的肠道菌群能够分泌促进营养物质消化吸收的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、磷酸酶等[10]。肠道菌群还能调节机体的非特异性免疫和特异性免疫[11]。如饲喂虹鳟鱼活的乳酸菌比死的乳酸菌更能刺激机体产生免疫反应，增强巨噬细胞的吞噬活性、提高补体和免疫球蛋白含量[12]，肠道优势菌群的改变可增强白细胞吞噬活性[13]。而抗生素的使用会破坏肠道菌群的动态平衡，导致疾病发生[14]。抗菌肽hepcidin 有助于恢复嗜水气单胞菌感染后的肠道菌群的多样性和组成[15]，抗菌肽可促进水产动物生长，增强机体特异性和非特异性免疫，提高抗病力[16-19]。抗菌肽将成为水产养殖业中最有潜力的饲料添加剂。

1 抗菌肽的来源及分类

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物机体为了抵抗外来病菌侵袭而迅速诱导产生的一系列具有抗菌或杀菌活性的多肽类物质。抗菌肽最早是由瑞典科学家Boman 等在研究天蚕的抗菌活性时发现的，后来将这种具有抗菌活性的物质命名为天蚕素(Cecropins)。随后具有类似生物活性的多肽不断地从微生物、植物、动物中被发现[20]。截止到2023 年1 月，抗菌肽数据库（APD）已经收入了3 569个抗菌肽。抗菌肽可来自动物、植物、微生物。

根据抗菌肽来源不同，可分4 类：①来自昆虫的抗菌肽。天蚕素是一种可诱导的抗菌肽，存在于天蚕蛹的血淋巴中。天蚕素作为其宿主防御系统的组成部分，可抵御细菌感染。昆虫防御素形成了一个独特的富含半胱氨酸的阳离子结构多肽家族，主要对革兰氏阳性菌有效。富含甘氨酸的抗菌肽可直接对抗真菌和革兰氏阴性菌以及癌细胞。富含脯氨酸的抗菌肽主要对革兰氏阴性菌有活性[20]。②来自其他动物的抗菌肽，包括哺乳动物、两栖动物和鱼类。如在猪的血液中性粒细胞中提取的抗菌肽，蛙皮中提取的抗菌肽，鱼类的黏液中提取的抗菌肽。③来自工程微生物的抗菌肽。利用重组方法以无活性形式在细菌中异源表达抗菌肽。如大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌等表达系统产生的抗菌肽。④人工合成抗菌肽。以已知的抗菌肽序列为模板合成新的具有较好的抗菌活性的抗菌肽，同时解决了获取天然抗菌肽耗时长、生产成本高、易被宿主蛋白酶降解等缺点[21]。LN-7、LR-10、AT-7、KR-1 都是以天然抗菌肽为模板根据两亲性和阳离子性设计合成的新型抗菌肽[22-24]，新型抗菌肽的阳离子性和疏水性都有所增强，所以新型抗菌肽对变异链球菌具有更强的抑制作用。

2 抗菌肽的生物学功能

抗菌肽是一种具有抗菌活性的碱性多肽，可通过与细胞内酸性物质结合、影响蛋白质合成等途径发挥作用。抗菌肽具抑制细菌、病毒、肿瘤和寄生虫等生长的功能，同时还具有免疫趋化活性，能够促使上皮细胞或分泌细胞产生趋化因子[25]。

2.1 抗菌功能

抗菌肽的抗菌功能具有高效性，对细菌具有抑制和杀灭作用。抗菌肽hepcidin 具有抗真菌活性，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有抑制作用，如Corego‐nus ussuriensis hepcidin 对鲍曼不动杆菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌均具有抗菌活性[26]。石斑鱼抗菌肽Sm-Hepcidin1 对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出抑制作用[27]。富含脯氨酸的抗菌肽（SpPR-AMP1）对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抗菌活性[28-29]。

2.2 抗病毒功能

抗菌肽可通过阻止病毒与宿主细胞结合抑制病毒[30]，或者直接与病毒结合，阻碍遗传物质的复制和病毒增殖，进而抑制病毒活性[31]。Urumin是从印度蛙皮肤中提取的抗菌肽，对H1N1 甲型流感病毒具有杀灭作用[32]。抗菌肽 hepcidin具有抗病毒活性[33]。

2.3 抗寄生虫功能

抗菌肽能有效抑制动物体内寄生虫繁殖，如天蚕素抗菌肽能有效抑制疟原虫生长[34]。有些宿主防御肽可以直接作用于寄生虫的细胞膜，使虫体内部形态遭到破坏而死亡，如昆虫源宿主防御肽对疟原虫的抑制作用。还有一些宿主防御肽通过改变寄生虫细胞内线粒体的膜电位，诱导寄生虫细胞凋亡，抑制寄生虫的活力[35-36]。

2.4 免疫调节功能

抗菌肽具有免疫调节功能，促使分泌细胞产生趋化因子[25]。抗菌肽免疫趋化活性表现在对中性粒细胞、肥大细胞和单核细胞的免疫趋化作用，促进吞噬细胞的吞噬功能。促使分泌薄壁细胞（上皮细胞）和巨噬细胞产生趋化因子IL-8 和MCP-1。抗菌肽参与免疫调节方式有3 种。①抗菌肽通过调节巨噬细胞调节免疫反应。抗菌肽通过调节巨噬细胞进行免疫应答或者直接杀灭细菌，从而促进巨噬细胞进行免疫应答；②抗菌肽增强了中性粒细胞吞噬细菌的能力和中性粒细胞的趋化性，促进肥大细胞释放组胺，增强血管的通透性；③抗菌肽促使成纤维细胞生长，促进伤口愈合，促进巨噬细胞进行特异性免疫，增强单核细胞的趋化性，使单核细胞能够迅速到达感染部位进行免疫反应[37]。

3 抗菌作用机制

抗菌肽由氨基酸和多肽按照不同的方式进行排列，氨基酸组成、空间结构、亲水性和疏水性都会影响抗菌肽的结构，与抗生素作用机制不同。抗菌肽的抗菌机制主要通过作用于细胞壁、细胞膜损伤和细胞内损伤。

3.1 作用于细胞壁

抗菌肽可直接与革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖前体脂质Ⅱ特异性结合，从而抑制细胞壁的生物合成。如β-defensin 3 通过结合肽聚糖前体脂质Ⅱ，抑制细胞壁肽聚糖合成，导致细胞受损，达到杀菌目的[38-39]。抗菌肽也可以通过激活自溶酶间接作用于细胞壁，切割肽聚糖从而破坏细菌细胞。

3.2 细胞膜损伤

细菌膜由磷脂双分子构成，具有亲水性和疏水性。抗菌肽常携带阳离子并呈两亲性（亲水性和疏水性），有助于它们吸引磷脂分子上的阴离子，进入到细菌的疏水膜中。抗菌肽分子以多聚体的形式插入或穿透细胞膜，形成跨膜空洞或穿孔，致使细胞内容物不断渗出，最终导致细菌死亡。或者抗菌肽像地毯一样不断在细胞膜表面聚集，导致细胞膜变形、破裂，也就是地毯模型[40]。

3.3 作用于细胞内靶点

抗菌肽在进入细菌细胞之后，与细胞内靶点特异性结合，干扰细胞代谢，达到抑制和杀灭细菌的目的。抗菌肽在细胞内阻断DNA 复制和RNA 合成，干扰蛋白质的合成，抑制细胞内酶的活性[39]。如buforin 类似物在进入细胞后通过结合DNA 和RNA 发挥对大肠杆菌的杀菌作用[40]。猪小肠中PR-39 可诱导DNA 复制过程中关键蛋白质降解，抑制细菌繁殖生长[39，41]。

4 抗菌肽对鱼类肠道菌群的影响

肠道免疫系统，也就是大家所熟知的肠道相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues，GALT），不仅仅能为机体提供免疫防御，还具有免疫调节功能。肠道黏膜中的上皮细胞和免疫因子与菌群之间存在复杂的相互作用，对GALT 的发育和成熟至关重要，肠道菌群能促进免疫系统发育，如细菌能通过经典的抗原依赖的特异性免疫应答途径促进GALT中B细胞的增生或直接激活先天免疫途径。

水生生物肠道微生物群落可被共生菌定植，被认为是一个潜在的病原体调控平台。抗菌肽通过动物摄食进入肠道，当识别到肠道有害菌时，抗菌肽会作用于细菌细胞膜，穿透细胞膜形成孔洞或者在细胞膜表面聚体到一定程度破坏细胞膜。例如抗菌肽BCp12 可通过降低大肠杆菌壁膜的表面疏水性，损伤菌体壁膜，从而引起胞内紫外吸收物质渗漏，菌体呈现自溶及空化现象，且以插入方式与DNA 结合，影响DNA 正常复制，从而抑制菌体增殖[42]。抗菌肽也可透过细胞膜在细胞内发挥作用，通过抑制细胞内功能，阻断酶活性或抑制蛋白质和核酸合成来杀死细菌。如抗菌肽P7 就是在细胞内聚集并与基因组DNA 结合，抑制大肠杆菌的活性[43]。有研究表明，100 µg/mL的抗菌肽indolicidin 就能够抑制大肠杆菌DNA 和RNA 的合成，150～200 µg/mL 的抗菌肽可抑制蛋白质的合成[37]。

抗菌肽不仅能抑制有害菌生长，还能促进肠道有益菌增殖。如在黄鳝基础饲料中添加 600 mg/kg 基因工程抗菌肽，肠道致病菌比例比对照组下降10.2%，乳杆菌属占比例提高11.9%[44]。在凡纳滨对虾的基础饲粮中添加1.0%抗菌肽S100，可改善其肠道的菌群结构[45]。在斜带石斑鱼基础饲料中添加200 mg/kg 天蚕素抗菌肽能阻止致病菌在肠道上定植，使肠道弧菌数降低，促进乳酸菌繁殖[46]。50 mg/kg的抗菌肽Surfactin 可促进吉富罗非鱼肠道中乳酸菌繁殖, 抑制大肠杆菌增殖[47-48]。400～800 mg/kg 抗菌肽可改善草鱼肠道菌群结构，促进肠道健康[49]。这些试验结果均表明抗菌肽对鱼类肠道菌群有调节作用，能抑制有害菌增殖，促进有益菌繁殖。

抗菌肽还可通过调节宿主体内微生物群落发挥免疫功能[50-51]。肠道正常菌群在鱼类肠道黏膜免疫中具有重要的作用。鱼类肠道黏膜覆盖着的正常菌群就是一道防止病原菌入侵的天然免疫屏障，可以增强对机体的免疫保护[52]。研究表明，肠道菌群可以调节免疫因子MyD88、TNF-α和IL-6 的表达[53]，诱导肠上皮分泌免疫因子[54]。同时，宿主免疫系统也可以通过免疫球蛋白A（IgA）塑造微生物结构，调节肠道菌群平衡[55]。分泌型免疫球蛋白A 也是肠道微生物调节的重要因子[56]。鱼类中存在与IgA功能相似的黏膜免疫球蛋白T（IgT），在肠道的黏膜免疫中发挥关键作用[57]，这表明抗菌肽调节肠道菌群还可能是通过免疫系统完成。鱼类免疫系统调节肠道菌群的同时，肠道菌群也促进了鱼类免疫系统的发育和成熟，并激活宿主免疫反应，控制肠道病原菌过度增殖[58]。因此，有人认为肠道菌群与宿主之间相互依赖，相互影响[59]。由于鱼类肠道微生态系统的复杂性，目前抗菌肽对肠道菌群的调控及免疫相关机制还尚未清楚，需要进一步深入研究。

5 抗菌肽对鱼类免疫功能的影响

水产养殖业在高密度养殖条件下容易发生肠道感染，因此，提高肠道免疫对水产养殖业的发展至关重要。肠道免疫功能的激活能够提高机体免疫功能。抗菌肽可通过提高鱼类肠道免疫进而提高鱼体的免疫力。有研究表明，1%Hepcidin（rTH2-3）抗菌肽能增加石斑鱼肠道中微生物的多样性和免疫相关基因的表达[60]。草鱼饲粮中添加400～800 mg/kg 抗菌肽可通过改善肠道形态、提高消化和抗氧化能力、调节肠道菌群和免疫力，改善鱼类肠道固有的免疫系统和抗氧化能力[49]。抗菌肽还可以调节鱼类的非特异性免疫。适量抗菌肽能够增强鱼类血清抗氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶活性，促进细胞因子分泌，提高机体免疫功能[61-62]。在饲料中添加150～200 mg/kg 的天蚕素抗菌肽可提高湘云鲫的非特异性免疫能力[63]，添加200 mg/kg 的抗菌肽可提高大口黑鲈的抗氧化能力和免疫力[64]。不同蛋白水平饲料中添加抗菌肽对免疫功能的影响有所差异，其中48%蛋白水平饲料中添加0.02%的抗菌肽可显著增强赤点石斑鱼的抗氧化能力[65]。在水产养殖中添加抗菌肽可有效改善鱼体健康，上调水产动物免疫相关酶活性和免疫相关基因的表达[66]。如在基础饲料中添加400～800 mg/kg 复合抗菌肽可以提高草鱼的抗氧化能力，上调免疫相关基因IL8、TNF-α和IL-1β的表达，并能控制嗜水气单胞菌生长，增强抗病力[67]。以上研究已证明抗菌肽具有免疫调节功能，但因鱼类的种类、生长阶段、饲料组成、养殖环境及抗菌肽的种类、添加剂量等不同，抗菌肽对鱼类免疫功能的影响就会有所差异，在实际生产实践中需要根据实际情况进行应用，抗菌肽对鱼类免疫功能的调控机制还需要进一步深入研究。

6 前景与展望

鱼类健康生长依赖于肠道菌群的稳定和肠道屏障功能的完整。肠道菌群在调控肠道免疫中具有重要作用。肠道免疫的相关机制也是未来需要深入研究的课题。由于肠道菌群在肠道黏膜中的协同作用的复杂性，还有许多问题尚未清晰，如肠道共生菌对肠道免疫调节的机制，肠道菌群激活免疫应答的途径等。由于鱼类养殖环境及鱼类消化吸收结构的特殊性，抗菌肽在鱼类上的研究限制更多，报道更少。在未来的研究中，应该充分利用现代鱼类营养学、鱼类免疫学、分子生物学等多种研究方法对鱼类肠道菌群的代谢利用途径、免疫调控机制等做深入的研究。