1株牛蛙源贝莱斯芽孢杆菌的分离、鉴定及其生物学特性分析

2024-02-26杨美玲黄宇帆杜蔼媚赖明建吴雅丽

饲料工业 2024年2期

■ 杨美玲黄宇帆杨映于辉杜蔼媚赖明建吴雅丽

（1.佛山科学技术学院，广东省动物分子设计与精准育种重点实验室，广东佛山 528231；2.国药集团德众（佛山）药业有限公司，广东佛山 528000；3.佛山市农业科学研究所，广东佛山 528145）

牛蛙（Rana catesbiana）是一种可食用的大型蛙类，原产于北美，于1936—1958 年引进我国，20 世纪80 年代中期开始规模化养殖[1]。由于牛蛙对环境适应性强，繁殖迅速、生长快，肉白味美，营养价值高，是我国淡水养殖的重要经济动物之一[2]。随着牛蛙养殖业形势出现规模化、集约化后，养殖密度逐渐增加和水体环境恶化，容易诱发大量细菌病害，例如嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）会引起蛙类的败血症、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）会引起红腿病、浅黄假单胞菌（P.luteola）会引起歪头病等[3-5]，给牛蛙养殖业造成巨大的经济损失。目前，控制牛蛙细菌病害使用抗生素是主要的治疗手段，但抗生素的普遍应用已经引起日益严重的动物和环境的耐药性问题[6]。各种抗生素类药物替代品（如使用安全的益生菌）不仅可以应用于水产动物体内和水体环境，还可以促进水产动物的生长、控制疾病、改善免疫反应和调节水环境等[7-8]。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是一类产芽孢的革兰氏阳性菌，是解淀粉芽孢杆菌后期异型体，能促进动植物生长，具有广谱抑菌能力[9-11]。大量研究发现，贝莱斯芽孢杆菌可以作为动物饲料的添加剂，改善肠道微生物菌群结构、调控机体脂代谢和增强免疫力等[12-14]。徐淑琴等[15]从藏羚羊体内分离的贝莱斯芽孢杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及产气荚膜梭菌有较强的抑制能力。刘韶娜等[16]报道贝莱斯芽孢杆菌B13 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌有抑制效果。试验从健康牛蛙肠道内容物中分离、鉴定出一株贝莱斯芽孢杆菌对体外蛙源细菌病有拮抗作用，丰富了牛蛙源益生菌的种类，并进一步探究出最适培养条件，为牛蛙养殖过程中添加益生菌的应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

健康牛蛙120～150 g，购自广州海兴隆集团有限公司牛蛙养殖场，挑选活力好、无损伤、外观镜检并经抽样解剖检验确认无病；蛙源嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌均为本实验室分离、保存。

Arls®2x 自动鉴定系统及GPID 细菌鉴定试剂条购于美国Thermo Scientific 生物公司；细菌基因组引物和LB 培养基均购于生工生物工程（上海）股份有限公司；药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离、纯化

用75%乙醇消毒体表后在无菌条件下，将肠道内容物原液用生理盐水按梯度稀释，将稀释液（包括原液）均各取100 µL 涂布于LB 培养基，每个梯度重复3次，于28 ℃恒温培养箱中培养24 h。待出现单个优势菌落再多次划线培养，确定为纯培养物后保种，革兰氏染色并镜检。

1.2.2 拮抗菌的筛选

通过滤纸片抑制圈法[17]筛选，用比浊法调浓度至1.0×107CFU/mL 的蛙源嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌进行抑菌试验。观察抑菌情况，用直尺进行抑菌圈直径的测定，记录抑菌圈的大小并拍照。

1.2.3 菌株鉴定

1.2.3.1 生理生化鉴定

使用Arls®2x 自动生化鉴定仪鉴定菌株G1 的生化特性，试验步骤与结果判定按照说明书进行。

1.2.3.2 16S rRNA测序和系统发育分析

多次划线纯化后，挑取平板单菌落，通过16S rDNA 序列分析技术鉴定菌株。使用试剂盒根据说明书提取菌株的基因组DNA，通过聚合酶链反应（PCR）扩增提取DNA，进行琼脂糖凝胶电泳检测。将纯化后的PCR 扩增加产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，结果在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，利用MEGA7.0 软件构建其系统进化树。

1.2.4 药敏片试验

将分离菌用比浊法调浓度至1.0×107CFU/mL 的涂布于LB 平板上，采用K-B 纸片扩散法[18]判断菌株对抗生素的敏感性。于28 ℃的生化培养箱中培养48 h 后，用直尺测定抗生素的抑菌圈直径（mm），结果判定根据说明书。

1.3 生物学特性分析

将益生菌用比浊法调浓度至1.0×107CFU /mL 分别按1∶100（V/V）的比例转接至灭菌的肉汤培养基中，按添加量1%、2%、3%、4%、5%；培养温度分别在28、33、37、40 ℃；pH 为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；不同转速100、130、150、180、200 r/min 振荡培养；在最适接种量、发酵温度、摇床转速、pH研究其生长曲线。

上述每瓶配置100 mL的灭菌肉汤内，接种100 µL菌种子液，每组重复3 次。初始培养条件为28 ℃、150 r/min 的摇床内培养24 h。以空白培养基为对照，测定分光光度计测量600 nm 波长下的吸光度（OD600nm）。以菌液添加量、pH、温度、摇床转速、培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标分别绘制折线图。

2 结果与分析

2.1 内源拮抗优势菌的分离与筛选

采用平板稀释法从健康牛蛙肠道中分离得到12株细菌，将分离得到的细菌进行抑菌试验，初步筛选得到1 株对蛙源嗜水气单胞菌和蛙源铜绿假单胞菌具有较好抑制效果的菌株，如表1和图1所示，抑菌圈直径分别可达12 mm和14 mm，并将其命名为G1。

图1 G1菌株拮抗嗜水气单胞菌和铜绿假单胞菌结果

表1 G1菌株生化鉴定结果

2.2 拮抗菌株的鉴定

2.2.1 形态学及生理生化性质分析

菌株G1 形态特征和生理生化特性如图2 和表1，G1 菌落呈乳白色，向上凸起，表面湿润、光滑、不透明、有黏液性，为革兰氏阳性菌。生理生化性质鉴定显示G1 菌株对麦芽糖、果糖、七叶苷、蔗糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖反应为阳性；对木糖、纤维二糖、尿素、枸橼酸盐、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶反应为阴性。

图2 菌株G1的形态特征和革兰氏染色结果

2.2.2 分子生物学鉴定分析利

通过MegAlign 软件构建系统发育树（见图3），G1株与贝莱是芽孢杆菌为一簇，通过NCBI 网站中的BLASTN软件对菌株G1进行同源性比较，也发现菌株G1的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中贝莱斯芽孢杆菌株（登录号：MH603331.1）的16S rRNA 序列自然聚类，同源性达到99%以上。结合形态特征、生理生化鉴定以及16S rRNA 基因系统发育分析的结果，判定菌株为贝莱斯芽孢杆菌。

图3 G1菌16S rRNA 基因序列的系统发育树

2.3 拮抗内源菌的药敏结果

运用纸片法，由表2可见，G1菌株对环丙沙星、米诺环素、头孢呋辛、庆大霉素、丁胺卡那、阿奇霉素、红霉素、恩诺沙星、卡那霉素、阿莫西林、磺胺甲噁唑、麦迪霉素敏感（S）；对哌拉西林、氨苄西林中度敏感（I）；对四环素、利福平不敏感（R）。

表2 菌株G1药敏试验结果

2.4 生物学特性研究

菌株G1 在不同培养条件下的生长情况如图4、图5、图6、图7、图8 所示。菌株G1 的最适接种量为3%，OD 值为1.282；最适生长初始pH 为7，OD 值为1.118；最适转速为180 r/min，OD 值为1.434；在28～40 ℃的温度范围内均能生长，其中菌株G1 的最适生长温度为30 ℃，OD 值为1.518。G1菌株从4 h开始进入对数生长期，第18 h 进入停滞期。当18 h 时将G1菌液接入发酵培养基，可以提高菌株密度。

图4 不同接种量下G1生长情况

图5 不同pH下G1生长情况

图6 不同转速下G1生长情况

图7 不同温度下G1生长情况

图8 G1生长曲线

3 讨论

贝莱斯芽孢杆菌作为一类新型生防细菌，主要特点是增殖快、抗逆性强、抗菌谱广、生物安全性高，能促进动物生长、调节肠道微生态平衡、提高机体抵抗力，对多种水产动物细菌性病原菌具有明显的拮抗作用，如绿脓杆菌[19]、维氏气单胞菌[20]等。目前报道较多分离出的拮抗微生物主要有芽孢杆菌类、乳酸菌类、光合细菌类和酵母类等拮抗菌株[21]。有报道指出，宿主源性益生菌在肠道中具有更好的定植能力，从而有更好的益生特性[22]。曹海鹏等[23]从养殖池污泥中分离筛选了一株优良的鲟源嗜水气单胞菌拮抗芽孢杆菌；蒋启欢等[24]从养殖的银鲫肠道中分离纯化出一株拮抗嗜水气单胞菌的芽孢杆菌。本试验以蛙源嗜水气单胞菌和铜绿假单胞菌作为指示菌，从牛蛙肠道中筛选出一株拮抗菌株命名为G1。通过菌株形态特征和革兰氏染色、生理生化特性和16S rRNA 等试验确定G1 为贝莱斯芽孢杆菌。

发酵能力是衡量生物工程菌的一个重要指标，益生菌的快速增殖在肠道环境中更容易获得竞争优势，从而有效抑制微环境中的病原微生物生长[25-27]。而本试验从健康牛蛙肠道内分离到的贝莱斯芽孢杆菌G1，最适接种量为3%；转速为180 r/min；适培养时间为12 h；在不同酸碱环境中，生长速率不同，最适初始pH 为7；在25～40 ℃中都能生长，最适培养温度是30 ℃。由于蛙类为变温动物，牛蛙等蛙类的最适养殖温度为20～30 ℃[28]。在饲料加工过程中，常会在一定范围内提高加工温度，本试验分离贝莱斯杆菌可以耐受40 ℃高温，对高温环境具有一定耐受性，具有作为牛蛙饲料添加剂和生物工程菌的应用潜力。同种菌株最适培养条件差异不同这可能与试验室的培养条件、分离动物的不同以及培养方法等不同有关。王金燕等[29]发现对假交替单胞菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌有抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌DY-6，最适培养温度30 ℃，初始pH 为7，生长时间为10 h时菌株DY-6 生长最快；朱亚珠等[30]发现贝莱斯芽孢杆菌SW5对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌有抑菌活性，最适接种量为2%，培养温度35 ℃，初始pH 为5，培养时间为9 h菌株SW5生长最快。

抗菌药物在保证人类和动物健康的同时，也带来了严重的环境和自身的耐药问题。因为耐药菌不断出现，其携带耐药基因的传播日益受到人们的关注，所以益生菌的耐药性被作为益生菌安全性评价指标之一[31-32]。本试验研究发现贝莱斯芽孢杆菌G1 对阿莫西林等常见抗生素敏感，对四环素不敏感，为牛蛙养殖过程中科学用药提供指导意见。