基于网络药理学探讨升陷汤治疗慢性心力衰竭的作用机制

2024-03-12贾倩芳李习婉

河南医学研究 2024年3期

贾倩芳,李习婉

(新乡医学院第一附属医院康复医学科,河南新乡 453199)

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心脏结构或功能发生异常而导致心室充盈、射血功能下降的临床综合征,液体潴留、呼吸困难、运动耐量下降[1]为主要表现。CHF是各类心血管疾病恶化或终末阶段,住院率及病死率居高不下。流行病学资料显示,2012—2015年我国35岁以上的心力衰竭总患病率为1.3%,近15年增长了44%,病死率达4.1%[2]。因此,防治心力衰竭已成为我国重要民生问题。欧洲心脏病指出,心力衰竭的常用药物有血管紧张素转化酶抑制剂、抗醛固酮剂、β受体阻滞剂、利尿剂、强心苷类等,尽管可在短期内提供较好疗效,但长期使用易产生不良反应,如长期使用血管紧张素转化酶抑制剂可引起肝功能损伤、中性粒细胞减少等,β受体阻滞剂可导致血压降低,利尿剂可导致低钾血症、心律失常等问题[3-5]。

《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》[6]指出,中药联合西药能起到协同增效的作用,可明显改善CHF患者临床症状,增加活动耐量,甚至改善患者远期预后。升陷汤源于清末医家张锡纯的《医学衷中参西录》,组方为黄芪、柴胡、升麻、桔梗、知母,是大气下陷病证的代表方剂[7]。大量临床研究显示,以升陷汤为基础方治疗慢性心力衰竭临床疗效显著[8-9],但其治疗CHF的作用机制尚不明确。经网络药理学研究,中药复方可通过多成分、多靶点、全方位发挥治疗作用,与中医的整体观念和辨证论治方法相符合[10-11]。本研究使用相关数据库对升陷汤治疗CHF进行数据整合并分析,以提供进一步的理论支持。

1 升陷汤活性成分及靶点预测

将5味中药输入中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicines Syestems Pharmacology Platform,TCMSP),通过口服利用度(OB≥30%)、类药性(DL≥0.18)2项指标筛选活性成分,建立数据库。在TCMSP、Swiss Target Prediction、Pubchem三大数据库里获取药物活性成分作用靶点,整合并删除重复值,建立药物靶点蛋白数据库。

1.1 CHF的靶点预测

以“chronic heart failure”为检索词,登录GeneCard[12]数据库、OMIM数据库、Drugbank[13]数据库查找CHF的常见靶点,合并每个疾病数据库靶点,去重处理后得到CHF最终靶点。取药物及疾病交集靶点,作为潜在靶点。

1.2 PPI网络及药物-成分-靶点网络

将潜在靶点上传至String数据库,设置置信度>0.7,进行蛋白互作分析,并利用Cytoscape 3.7.2软件进行拓扑分析,获得核心基因,构建升陷汤-有效成分-作用靶点网络图。

1.3 升陷汤治疗CHF靶点功能通路富集分析

通过David数据库进行功能通路富集,并可视化处理富集结果。

2 结果与分析

2.1 药物活性成分及靶点筛选

在TCMSP数据库中,通过OB、DL值,得到升陷汤有效成分共56个;对应靶点1 108个,去除重复值得到295个靶点。见表1。

表1 升陷汤药物活性成分

表1(续)

2.2 疾病靶点预测

使用 GeneCards数据库搜索“chronic heart failure”,查找与CHF相关靶点,提取评分较高(score≥5)的相关基因靶点,共得到 4 525 个;使用OMIM数据库,去除重复值,最终得到618个基因靶点;使用Drugbank数据库,得到CHD相关基因靶点10个;合并并删除重复值,得到4 988个靶点。

2.3 潜在靶点预测

使用 Venny 2.1在线作图工具,将升陷汤靶点与CHF靶点取交集,获得作用靶点141个。见图1。

CHF为慢性心力衰竭。

2.4 PPI网络及升陷汤-有效成分-作用靶点网络构建

通过String平台对升陷汤治疗CHF潜在靶点进行靶标蛋白互作PPI网络构建,得到蛋白结构及功能与基因之间相互作用关系,将TSV文件导入Cytoscape软件,得到节点139个,边2 113条的PPI 网络图,如图2所示。得到中介中心度(betweenness centrality,BC)、接近中心度(closeness centrality,CC)、度值(Degree)和基于局部平均连接度的方法(LAC)的中位数分别是113.606 8、0.566 738、46.5、30.564 39,得到节点21个,按Degree值排序,分别为PTGS2、STAT3、TP53、EGFR、MMP9、BCL2L1、CASP3、IL-10、IL-6、TNF、HSP90AA1、HIF-1α、AKT1、CCND1、VEGFA、MTOR、PPARG、RELA、MAPK14、ESR1、ERBB2。如图3所示。其中度值越大,成为核心基因[14]可能性越大,将中药、有效成分、靶点导入Cytoscape软件中,构建“中药-有效成分-靶点”网络,如图4所示。通过分析,kaempferol、quercetin、stigmasterol、isorhamnetin、luteolin、7-O-methylisomucronulatol、formononetin等可能是治疗CHF的主要活性成分。见表2。

图2 PPI 网络图

图3 核心基因筛选

图4 药物-有效成分-作用靶点网络

表2 关键活性成分

2.5 基因本体(gene ontology,GO)功能与京都基因和基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析

GO富集分析得到362个条目,分别是生物过程(biological process,BP),细胞组成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3个方面,其中BP 290条,CC 26条,MF 46条,分别取P值排名前20的条目绘制气泡图,见图5、6、7。GO富集结果显示,分子功能主要涉及酶结合、蛋白激酶结合、同一蛋白结合、蛋白磷酸酶结合、一氧化氮合酶调节活性、转录因子结合、组蛋白脱乙酰酶结合等;生物过程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子对pri-miRNA转录的正调控、凋亡过程的负调控、基因表达的正调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、肽基丝氨酸磷酸化的正调控、转录的正调控、DNA模板化、细胞对缺氧的反应、一氧化氮生物合成过程的正调控、蛋白质磷酸化的正调节、平滑肌细胞增殖的正调控等;细胞组成主要涉及高分子复合物、细胞质、转录因子复合物、细胞溶胶、核质、谷氨酸能突触等。KEGG富集结果显示,升陷汤治疗CHF主要涉及AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路。见图8。

GO为基因本体;BP为生物过程。

GO为基因本体;CC为细胞组成。

GO为基因本体;MF为分子功能。

KEGG为京都基因和基因百科全书。

3 讨论

CHF作为一种临床综合征,是多种心血管疾病发展的终末阶段,以改善肾素-血管紧张素-醛固酮系统、交感神经系统及利钠肽系统紊乱,从而抑制心肌纤维化及心室重塑,改善临床症状及预后[15]。中医古籍中无“心力衰竭”的记载,但根据临床症状可将慢性心力衰竭归属于“水肿、心悸、喘证”等,其病位在心,关乎五脏,总为本虚标实,其中心气、心阳亏虚为本,血瘀、水停为标。王振涛教授认为CHF以本虚为发病基础,宗气亏虚而下陷是CHF的主要病机,并认为CHF早期出现心悸、气短、呼吸困难、乏力的症状与宗气亏虚有关[15]。张锡纯的《医学衷中参西录》大气下陷病证中有多半属于CHF临床症状,认为大气下陷虽然像喘,其实是大气下陷太甚,呼吸无力,而代偿性努力呼吸的表现。因此,益气升陷为治疗CHF的根本大法。张超等[16]通过观察加味升陷汤对气虚水停型CHF临床疗效,发现治疗组总有效率高于对照组,临床症状、心功能明显改善。张玉焕等[17]通过研究发现升陷汤隔药灸治疗气虚血瘀型慢性心力衰竭的效果显著,且明显降低患者血清氨基末端脑钠肽前体、炎症因子水平。

升陷汤治疗CHF临床疗效确切,但目前鲜有文献报道升陷汤治疗CHF的机制。本研究应用网络药理学对其分析示:从56种活性成分中筛选出山奈酚、槲皮素、豆甾醇、异鼠李素、木犀草素、芒柄花黄素、黄芪皂苷类等10个关键活性成分;从141个交集靶点筛选出PTGS2、EGFR 、TP53、STAT3、MMP9等20个重要靶点;通过KEGG富集筛选出AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等重要通路。升陷汤可能抑制心肌细胞凋亡、改善心室重塑、抑制炎症反应及氧化应激发挥治疗CHF的作用。

3.1 关键活性成分分析

本研究发现升陷汤治疗CHF的主要活性成分有6大类,分别是山柰酚、槲皮素、豆甾醇、异鼠李素、木犀草素、黄芪皂苷类等。其中山柰酚、槲皮素、木犀草素、异鼠李素都属于黄酮类化合物,山柰酚可调节SIRT1介导的线粒体途径,减轻心肌细胞损害[18],并可通过TLR4/NF-κB途径产生抗心肌细胞凋亡作用[19]。槲皮素可通过调控AKT1-eNOS-MMP9通路减少HF细胞模型凋亡蛋白的表达,抑制CHF的病理生理进程[20]。木犀草素可能通过活化PI3K/Akt/mTOR信号通路,改善CHF大鼠心功能,抑制心室重塑[21-22]。异鼠李素通过调控H9c2心肌细胞自噬和凋亡通路蛋白表达,提高细胞存活率,减轻心肌细胞损伤[23],抑制心肌TGF-β/Smad信号通路,改善心肌纤维化[24]。芒柄花黄素可降低乳酸脱氢酶活性、肌酸激酶及丙二醛水平,升高超氧化物歧化酶活性,对H9c2心肌细胞发挥保护作用[14]。黄芪皂苷可通过抑制 PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化,调节 Bcl-2、Bax蛋白表达,从而抑制心肌细胞凋亡[25-26]。

3.2 关键靶点结果分析

通过Degree值得出核心靶点,PTGS2、STAT3、TP53、EGFR、MMP9、BCL2L1、CASP3、IL-10、IL-6、TNF、HSP90AA1、HIF-1A、AKT1、CCND1、VEGFA、MTOR、PPARG、RELA、MAPK14、ESR1、ERBB2。PTGS2参与炎症反应、细胞增殖、细胞凋亡等多种病理过程[27]。STAT3参与细胞生长、凋亡等过程,可抑制转录活性减少内皮细胞的增值、迁移及血管形成[28]。TP53作为转录因子,能调节心肌素的表达,通过抑制TP53介导的心肌素表达而抑制心肌细胞自噬,减轻心肌缺血及再灌注损伤[29]。心肌缺血再灌注时产生大量炎症因子,IL-10、IL-6作为有效的炎症抑制因子,在下调炎症反应中发挥重要作用[30]。AKT1对心脏的影响表现为抑制心肌细胞凋亡,有研究表明,心力衰竭小鼠p-AKT1呈低表达,因此,激活AKT1对CHF具有一定治疗作用[31]。进一步说明升陷汤加减可以多成分、多靶点作用于CHF。

3.3 通路与生物进程分析

GO富集分析结果表明,升陷汤的作用靶点分布于多种细胞结构,以高分子复合物、细胞质、转录因子复合物、细胞溶胶、核质、谷氨酸能突触最为显著。升陷汤成分主要在酶结合、蛋白激酶结合、同一蛋白结合、蛋白磷酸酶结合、一氧化氮合酶调节活性、转录因子结合等分子层面发挥作用,有多个生物学过程参与,主要与氧化应激、细胞凋亡等有关。

KEGG富集结果显示,升陷汤治疗CHF主要涉及的通路是:AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等。PI3K-Akt信号通路可以调节细胞的分裂、分化、凋亡等生物学过程,是CHF主要涉及信号通路的中心环节,激活该通路可保护离体大鼠心脏心肌细胞免受损伤[32],激活PI3Kα促进TNF-β和miR-21表达,抑制心肌增厚肥大,PI3K-Akt信号通路的下游靶点mTOR、GSK3、Fox Os等亦可参与CHF过程[33]。AGEs通过与其受体RAGE结合,引发氧化应激,通过激活核因子κB诱导炎症反应及平滑肌增生从而导致血管内皮损伤,该通路主要在糖尿病引起的心肌病中发挥重要作用[34]。HIF-1信号通路[35]、IL-17信号通路[36]均参与心肌纤维化、心室重塑的病理过程。由此说明升陷汤加减治疗CHF可通过多条信号通路参与治疗CHF,并推测其治疗机制可能与调控心肌细胞凋亡、改善心室重塑关系最为密切。