一株羊源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐药分析

蒋昀轩，杨 亚，魏 凯*

（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018；2.山东省泰安市宁阳县畜牧兽医事业发展中心，山东 宁阳）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一种可以引起人和多种动物患病的条件性致病菌。该菌主要导致人和多种动物的肺炎、呼吸道感染、肠炎、腹膜炎、脑膜炎、腹泻，甚至败血症等症状[1]。目前，国内外已从多种家畜、家禽、野生动物、水生动物体内分离到该菌[2]。近年来，关于肺炎克雷伯氏菌致病的报道越来越多，其已经成为除大肠杆菌、沙门氏菌之外常见的条件致病菌[3]。由于抗生素的滥用导致该菌耐药性不断增强，全国各地出现了高耐药性菌株，大大增加了该菌所致疾病的发生率和死亡率，给临床治疗带来严重困难，也给畜牧养殖业造成了巨大经济损失[4]。2022年7月，山东莱芜某养羊场出现黑山羊乳羔羊死亡情况，患病羊发病急促，眼珠泛红，被毛凌乱，呼吸困难，原地打转且伴有一定的神经症状，两天后精神沉郁，食欲减退，高烧不退，精神萎靡，随后便倒地死亡。对死亡羔羊进行剖解检查，可见皮下水肿，肺脏内部出现淤血，表面有大的出血点与出血斑，肝脏肿大，大网膜充血出血，肠系膜淋巴结出血，并且表现一定程度的败血症症状。

本实验室通过细菌的分离纯化、生化试验、药敏实验等方法，对莱芜黑山羊的肺脏、肝脏等组织器官进行细菌学检查，分离到一株羊源肺炎克雷伯氏菌，旨在为临床上肺炎克雷伯氏菌的防治与耐药性的研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 从山东济南莱芜区某养羊场收集到莱芜黑山羊尸体，采用无菌操作解剖并采集了2 只病羊的肝脏与肺脏病料。

1.1.2 主要试剂及试验动物 琼脂糖粉、核酸染料均购自TaKaRa 公司；LB 培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、新鲜绵羊血培养基购自青岛海博试剂有限公司；药敏片由本实验室保存；细菌DNA 提取试剂盒购自康为世纪有限公司；革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；SPF 级昆明小鼠购自山东鹏悦实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 分离株的分离培养 用酒精灯消毒过的剪刀烧烙肝脏和肺脏表面，并剪取肝脏和肺脏内部的组织0.5 g 于10 mL 离心管中，然后将病料组织剪碎，加入3～4 颗灭菌后的钢珠以及5 mL 生理盐水，使用全自动组织研磨机研磨5 min。在超净台中用接种环蘸取病料研磨液在麦康凯培养基、LB 培养基、新鲜绵羊血琼脂培养基、伊红美蓝培养基上划线培养，并做好标记，放入37 ℃温箱过夜培育，24 h 后观察菌落形态特征，挑取典型菌落进行纯培养。

1.2.2 革兰氏染色 使用革兰氏染色试剂盒将分离纯化到的菌液进行革兰氏染色，观察细菌的形态特征和染色特征。

1.2.3 分离株的细菌质谱仪鉴定 用灭菌的枪头轻轻蘸取伊红美蓝培养基上的单菌落均匀涂布于MSP 96 target polished steel BC 上，然后滴加浓度为 70%的甲酸1 μL，晾干后再加入基质溶液1 μL，使用布鲁克全自动快速生物质谱检测仪鉴定。

1.2.4 分离株的PCR 检测 根据文献设计羊源肺炎克雷伯氏菌特异性鉴定引物：KpYF5'-GCGG TCTGTCAAGTCGGATGTG-3' KpYR5'-CATCGT TTACGGCGTGGACTACC-3'，交由北京擎科生物有限公司合成。

将纯化后培养的细菌肉汤取5 mL，使用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取细菌DNA 作为模板，加入到反应体系中进行PCR 扩增（表1）。按照反应条件进行扩增：预变性94 ℃ 6 min；变性 95 ℃ 30 s；退火 55 ℃ 30 s；延伸 72 ℃1 min；35 个循环；延伸72 ℃ 10 min。反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带大小。PCR 产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，送到青岛擎科生物技术有限公司进行双向测序，测序结果通过NCBI 数据库进行BLAST，比较其同源性。

1.2.5 分离株的生化试验 将分离到的菌液肉汤按照说明书要求，加入到各种类型的生化反应管中，37 ℃ 培养24～48 h 后观察细菌生化反应特性。所有试验操作过程均在超净台中进行，避免实验室污染对试验结果造成影响。

1.2.6 小鼠的致病性试验 通过倍比稀释的方法测的菌液浓度为2x109CFU，根据菌液浓度，同时设立感染组15 只和空白对照组15 只。将菌液肉汤给小鼠进行腹腔注射（200 μL/只）。空白组每只注射200 μL 生理盐水。在小鼠死亡后采集小鼠心血加入LB 肉汤中继续培养。

1.2.7 分离株的药敏试验 通过倍比稀释涂板，24 h 后测量菌液CFU，然后将分离纯化的细菌接种于普通LB 液体培养基中培养24 h。根据测量的菌落CFU 单位对菌液进行定量后涂板，稍干后共选取20 种药敏片分别平铺在培养基表面，37 ℃ 过夜培养，用直尺测量培养基上抑菌圈直径大小。分离菌株的药敏试验参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准K-B 纸片法进行，以抑菌圈直径（mm）表示该药对特定细菌的敏感程度，分别用敏感（S）、中度敏感（I）、耐药（R）表示。

2 结果

2.1 分离株细菌形态学上的观察

利用细菌分离的方法，从本次的病料中获得一株疑似肺炎克雷伯氏菌分离株，分别在LB 琼脂培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、新鲜绵羊血培养基进行划线培养，24 h 观察到在LB 培养基上形成灰白色、边缘整齐、圆形突起、湿润且粘稠的菌落，使用接种环可以轻易拉成丝（图1 A）；在麦康凯培养基上呈现大片粉红色菌落（图1 B）；在伊红美蓝培养基上形成灰白色、边缘整齐、圆形突起、湿润且粘稠的菌落（图1 C）；在新鲜绵羊血培养基上形成白的粘稠状菌落，且不溶血（图1 D）。

2.2 革兰氏染色镜检

将分离株进行革兰氏染色，使用油镜观察后发现视野中分离菌株为红色，呈短杆状形态，表明其为革兰氏阴性菌（图2）。

图2 分离菌株革兰氏染色结果（100x）

2.3 分离株的生化试验结果

分离株的生化试验结果显示，赖氨酸脱羧酶、尿素酶、甘露醇、枸橼酸盐、VP 试验、核糖醇、棉子糖、山梨醇、蜜二糖、试验均为阳性；吲哚、硫化氢、蛋白胨水、甲基红试验、苯丙氨酸、鸟氨酸脱羧酶试验为阴性（表2）。分离株的生化特性结果同《临床常见细菌鉴定手册》的肺炎克雷伯氏菌的生化特性相符合。根据生化试验结果，初步判定分离菌为肺炎克雷伯氏菌。

图3 分离菌株在不同培养基上的形态

表2 分离株生化试验结果图

2.4 小鼠致病性试验

感染组小鼠腹腔注射菌液后，在24 h 内陆续死亡，死亡前被毛凌乱、呼吸加重、精神萎靡、食欲不振，还有部分全身颤抖、眼睛紧闭。剖解死亡的感染组小鼠，发现其腹腔出现大量粘连液体，成胶冻状，肝脏、肺脏出现大量出血点、坏死，脾脏肿大。取其心血，肺脏、肝脏研磨液，使用LB 肉汤继续进行细菌培养，通过革兰氏染色镜检结果显示，该分离株与病羊肺脏、肝脏组织中分离到的细菌相同，且对照组无异常反应。

2.5 PCR 检测结果

使用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取细菌DNA 作为模板，进行特异性PCR 鉴定，PCR 产物经1%琼脂糖核酸电泳，结果如图3 所示，目的条带大小与预期结果一致。琼脂糖凝胶经回收后送到青岛擎科生物有限公司测序，测序结果经BLAST 分析比对，该菌株部分基因序列与肺炎克雷伯氏菌同源性达99%，确定该菌为羊源肺炎克雷伯氏菌。

图3 PCR 鉴定结果

2.6 药敏试验结果

根据药敏试验说明书的说明，判断各种药物的抑菌圈直径，发现羊源的分离菌KpY1、KpY2对β-内酰胺类、氨基糖苷类等大多数药物均为敏感，对磺胺间甲氧和阿莫西林表现耐药（表3）。

3 讨论与结论

目前，肺炎克雷伯氏菌已经与大肠杆菌、沙门氏菌一样，对人类健康以及畜牧业构成威胁的常见的细菌病原体之一[5]。在我国的畜牧生产中，养羊产业逐渐形成了一种完整的产业链，对经济发展起着十分重要的作用，严格控制养羊场各种疫病的发生以及病原的感染与传播对养羊业的健康发展至关重要[6]。羊源肺炎克雷伯氏菌作为一种危害性强的条件致病菌，当符合发病条件时，会对人和动物机体和健康造成严重的影响。羊源肺炎克雷伯氏菌感染后主要引起呼吸困难、肺炎、脑膜炎、全身败血症以及一定的神经症状，最终使病羊因呼吸系统衰竭而死亡[7]。因此，对于羊源肺炎克雷伯氏菌需要建立有效的预防措施，为养羊业发展起到有效的保护作用。肺炎克雷伯氏菌作为在临床上仅次于大肠杆菌与沙门氏菌的条件致病菌，与预防和治疗有着密不可分的联系，抗生素的滥用导致了多重耐药性菌株的出现。本次试验分离到肺炎克雷伯氏菌致病性强，耐药性弱，对多种药物敏感，为临床药物的研究提供了支持与依据[8]。同时本次病料检测时还发现了大肠杆菌的存在，表明肺炎克雷伯氏菌易与其他细菌混合感染，造成治疗难度增加，提示相关从业人员与政府部分应提高警惕，做好对混合发病感染的预防和研究，一旦暴发疾病，迅速根据其发病规律，制定科学合理的治疗手段。

本研究是将由羊肺脏、肝脏中分离到的菌株通过细菌的形态学观察、动物致病性试验、生化试验、药敏试验、PCR 检测等方法，从多个方面鉴定并确定了分离菌株为有较高致病性的肺炎克雷伯氏菌。药敏试验的结果显示，羊源的肺炎克雷伯氏菌对大多数抗生素类药物敏感，只对阿莫西林和磺胺间甲氧表现为耐药，表明目前从莱芜黑山羊病料中分离到的肺炎克雷伯氏菌的耐药性不强，没有出现多重耐药性，说明还具有一定的预防价值，并且对于下一步检测方法的研究具有重大意义，早发现早治疗，能够起到预防肺炎克雷伯氏菌多重耐药性发生的作用。同时本试验中的数据以及相关耐药性分析的结果为动物源肺炎克雷伯氏菌检测方法的建立提供了数据支持。