高效液相－串联质谱法测定蜂蜜中利巴韦林残留研究

杨修镇，刘霄飞，李玉姣，赵丰华，张桂萍

（山东省畜产品质量安全中心，山东 济南 250010）

囊状幼虫病和麻痹病为蜜蜂养殖过程中常见的病毒性传染病[1]，治疗主要使用抗病毒类药物。常见的抗病毒类药物主要有金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍和阿昔洛韦，其中蜂蜜中金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍和阿昔洛韦残留检测方法已有研究[2-3]，而利巴韦林残留检测尚无相关报道。利巴韦林是广谱强效抗病毒药物[4]，有公开申请的专利[5]使用利巴韦林治疗蜜蜂麻痹病，说明利巴韦林在蜜蜂养殖过程中是有使用的。农业部在2005年颁布的《中华人民共和国农业部公告第560 号》将从人用药物移植兽用的利巴韦林等抗病毒药物从兽药中移除。虽然2019年发布的《中华人民共和国农业农村部公告第250 号》食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单中并未列入利巴韦林，但利巴韦林目前未被再次批准为兽药，依据《兽药管理条例》禁止使用人用药、原料药及未经国家批准或已淘汰的兽药，利巴韦林属于畜牧生产过程中禁止使用的药物。为建立蜂蜜中利巴韦林残留检测方法，本试验采用液相色谱-串联质谱法对其进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 TQ-S 液相色谱串联质谱仪（美国沃特斯公司）；PL-602E/02 电子天平（感量0.01 g,瑞士Mettler 公司）；XPE205 电子天平（感量0.00001 g，瑞士Mettler 公司）；UVS-1 小型涡旋混匀器（北京优晟联合科技有限公司）；VX-Ⅲ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）；CR-21G 离心机（日本日立工业株式会社）；UGC-45C 圆形水浴氮吹仪（北京优晟联合科技有限公司）；IQ7000 超纯水器（美国Milli-Q 公司）。

1.1.2 试剂 利巴韦林标准品（纯度99.9%，Dr. Ehrenstorfer 公司）；13C5-利巴韦林标准品（纯度99.9%，Dr. Ehrenstorfer 公司）；混合型阳离子交换固相萃取小柱（500 mg，6 mL，美国Agilent 公司）；有机滤膜（0.22 µm）；蜂蜜（山东省畜产品质量安全中心提供）；甲酸、甲醇为色谱纯；水为一级水，其余试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 准确称取利巴韦林标准品和13C5-利巴韦林标准品各10 mg，用甲醇溶解并配制成浓度分别为1 mg/mL 的储备液。用移液器分别移取1 mg/mL 的利巴韦林储备液和13C5-利巴韦林储备液各100 µL，分置100 mL 容量瓶中，用10%（V/V）甲醇溶液配制成浓度各为1 µg/mL的溶液。用单标线吸量管吸取1 µg/mL 的13C5-利巴韦林溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用10%（V/V）甲醇溶液配制成浓度为 100 ng/mL 的13C5-利巴韦林溶液。

1.2.2 样品前处理 称取蜂蜜样品2±0.01 g，置50 mL 离心管中，依据参考文献[6-11]方法，用移液器加入100 ng/mL13C5-利巴韦林溶液100 µL，涡旋混匀，放置10 min，再加入2%（V/V）甲酸溶液10 mL，振摇提取5 min，8 000 r/min 离心5 min，上清液转入另一个50 mL 离心管中，备用。

取备用液全部通过经5 mL 甲醇、5 mL 水活化后的混合型阳离子交换固相萃取小柱，再依次用水5 mL、2%（V/V）甲酸溶液5 mL、甲醇5 mL 淋洗，抽干，用5%（V/V）氨水甲醇溶液5 mL 洗脱，40 ℃ 水浴氮气吹干，准确加入10%（V/V）甲醇溶液1 mL 溶解残渣，涡旋1 min，过滤，供上机测定。

1.2.3 色谱条件 利巴韦林极性较大，在普通C18反相色谱柱上几乎不保留，依据参考文献[12]方法，选用 Hypercarb 多孔石墨碳色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 µm）；柱温：40 ℃；流动相：A 相为甲醇，B 相为水，为促进离子化两相均含0.1%（V/V）甲酸；流速：0.25 mL/min；进样体积：2µL。流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.2.4 质谱条件 电离模式为ESI+；碰撞气为氩气；采集方式为多反应监测（MRM），具体参数见表2。

表2 利巴韦林及其内标检测质谱参数

1.2.5 标准曲线绘制 用移液器吸取1 µg/mL 的利巴韦林溶液和1 µg/mL 的13C5-利巴韦林溶液适量，分置10 mL 容量瓶中，用10%（V/V）甲醇溶液配制利巴韦林浓度为2、4、10、20、50、100 ng/mL，内标13C5-利巴韦林浓度均为10 ng/mL 的系列标准溶液，上机测试。

1.2.6 基质效应评估 取空白洋槐蜜、荆条蜜、枣花蜜、百花蜜各一批，按样品前处理方法处理至40 ℃水浴氮气吹干，分别准确加入10 ng/mL利巴韦林溶液1 mL，涡旋1 min，过滤，注入高效液相-串联质谱仪，按规定条件进行测定，所得定量离子峰面积与10 ng/mL 利巴韦林溶液定量离子峰面积进行比较，发现各蜂蜜样品均有不同程度的基质抑制效应，且各蜂蜜样品的基质抑制程度差别较大，故定量方法选择同位素内标法。

1.2.7 专属性 依据参考文献[13-15]方法取空白蜂蜜样品进行空白试验和空白添加试验。

1.2.8 检出限和定量限 取空白蜂蜜，添加一定量利巴韦林，按照参考文献[16]给出的规则进行方法检出限和定量限的测定。

1.2.9 方法准确度 采用空白加标法，取不含利巴韦林的蜂蜜样品3 批，按照2 μg/kg、4 μg/kg、20 μg/kg 添加利巴韦林，每个浓度点平行测定5次，计算回收率，求批内、批间相对标准偏差。

2 结果

2.1 标准曲线绘制

以相应利巴韦林浓度与13C5-利巴韦林浓度的比值为横坐标，利巴韦林定量离子峰面积和13C5-利巴韦林定量离子峰面的比值为纵坐标，绘制标准曲线（图1）。回归方程为：y = 1.3268x -0.0642，曲线的R2为0.9995，在2～100 ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

图1 利巴韦林标准曲线图

2.2 专属性评估

取空白蜂蜜样品进行空白试验和空白添加试验，结果显示空白样品无干扰（图2～图4）。

图2 利巴韦林及其内标离子色谱图

图3 蜂蜜空白样品离子色谱图

图4 空白蜂蜜添加利巴韦林离子色谱图

2.3 方法检出限和定量限

取空白蜂蜜，添加一定量利巴韦林，按照参考文献的要求，确定本方法检出限为1 μg/kg，定量限为2 μg/kg。

2.4 方法准确度

从表3 可以看出，利巴韦林在蜂蜜中的加标回收率为67.6%～112.7%，批内、批间RSD＜15%，能够满足蜂蜜中利巴韦林残留检测的要求。

表3 准确度实验结果

3 讨论与结论

利巴韦林是强极性化合物，其极性与蜂蜜中的主要成分果糖、葡萄糖相近，前处理过程中无法采用极性差异进行分离净化。利巴韦林具有弱碱性，果糖、葡萄糖具有弱酸性，依据这一化学性质差异，前处理采用混合型阳离子交换固相萃取的方法实现了良好分离。

流动相的选取比较了甲醇水系统和乙腈水系统，甲醇水系统能够实现更好的分离，毒性低、价格便宜，故以甲醇水系统为流动相，利巴韦林具有弱碱性，0.1%甲酸的加入有利于其离子化。

本文建立的蜂蜜中利巴韦林残留检测方法，前处理方法简单，采用固相萃取柱净化降低了基质干扰，同位素内标法定量准确度高、重复性好、灵敏度高，适用于蜂蜜中利巴韦林残留量的检测。