山苍子精油对痤疮丙酸杆菌生物膜破坏及毒力酶释放的影响

陈 静，张佳宁，田红茹，，赵志敏，，徐新军，朱龙平，杨得坡，*

（1.中山大学药学院，广东 广州 510006； 2.广东省现代中药工程技术研究开发中心，广东 广州 510006）

目前，痤疮、脑膜炎、败血症等细菌感染性疾病已越来越引起人们的重视，而细菌的致病性与诱导感染的能力与生物膜的形成及毒力因子的分泌密切相关［1-5］。痤疮丙酸杆菌Cutibacteriumacnes作为一种条件致病菌，其在面部过度繁殖是痤疮产生的主要原因之一，它还可以释放一系列毒力因子或脂肪酶等毒力酶导致皮肤细胞产生炎症反应，诱导痤疮的发生［6-7］。同时，痤疮丙酸杆菌产生生物膜帮助其留置于医疗器械上，增加置换手术术后感染的风险［8］。目前，很多天然产物具有良好的抑菌效果且不易产生多重耐药性，可作为理想的抗菌剂使用［9］。

山苍子是樟科木姜子属植物山鸡椒Litseacubeba（Lour.） Pers.的果实，是我国传统木本精油植物资源，其挥发油具有浓郁的柠檬香味，是常见的的天然食用香料［10］。现代研究发现，山苍子精油主要成分有柠檬醛、柠檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-侧柏烯、桧烯、β-蒎烯、α-松油醇、β-月桂烯等，具有抑菌、抗炎、杀虫等良好的药理活性，在化妆品、食品、医药、化工及畜禽养殖等领域有着广泛的应用潜力［10-11］。

本实验对比了山苍子精油主要成分对痤疮丙酸杆菌的抑菌活性，通过探究精油对菌生物膜的破坏及毒力酶分泌的影响及对痤疮丙酸杆菌致病性的抑制作用，以期为其应用提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 山苍子成熟果实于7 月中旬采自广东省广州市从化区，经中山大学药学院杨得坡教授鉴定为正品，保存于中山大学药学院生药学与天然药物化学实验室。

柠檬醛、桧烯对照品（纯度98%、98%，上海源叶生物科技有限公司）； 柠檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、β-蒎烯、α-松油醇、β-月桂烯对照品（纯度95%、98%、98%、95%、98%、90%，上海麦克林生化科技有限公司）； α-侧柏烯对照品（纯度95%，信阳莱耀生物科技有限公司）。

Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司； 脂肪酶试剂盒Lipase assay kit 购自南京建成生物工程研究所； 结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 培养基 脑心浸出液肉汤（BHI） 干粉购自广东环凯微生物科技有限公司； 强化梭菌琼脂（RCA） 购自上海吉至生化科技有限公司。

1.3 菌株 痤疮丙酸杆菌 （Cutibacteriumacnes，ATCC6919） 由中山大学药剂学徐月红课题组赠予，保存于中山大学药学院生药学与天然药物化学实验室。

1.4 仪器 紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； Synergy H1 型酶标仪 （美国Bio-Tek 公司）；CytoFLEX S 型流式细胞分析仪（美国贝克曼库尔特公司）。

2 方法

2.1 山苍子精油主要成分对细菌的MIC 测定 课题组前期研究表明，山苍子精油对痤疮丙酸杆菌有较好抑制作用［12］。根据美国临床和实验室标准化协会（CLSI） 推荐，采用微量二倍稀释法测定山苍子精油主要成分对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度（MIC）［13］，将相应对照品连续对半稀释后加入96 孔板中，1.0×105CFU/mL 大肠杆菌在质量浓度19.2～0.009 375 mg/mL 的精油中厌氧培养48 h 后测定MIC，设置阳性对照为氨苄西林，阴性对照为0.1% 吐温80 溶液，每个浓度3 个平行，每组重复3 次。

2.2 山苍子精油对痤疮丙酸杆菌生物膜形成的影响

2.2.1 细菌表面疏水性测定 根据唐才林等［14］报道并作适当修改，将不同质量浓度精油组（200、400、800 μg/mL）、对照组（0.1%吐温80 溶液） 菌液于37 ℃厌氧条件下培养6 d，培养结束后调整菌液OD600为0.5±0.05，加入2 mL 正十六烷至3 mL 菌悬液中，涡旋60 s混匀，室温下静置30 min，待有机相完全分离后吸去上层有机相，取水相测定值，并借助疏水性指数对细菌表面疏水性进行量化，公式如下。

2.2.2 细菌生物膜形成测定 参考先前研究方法，采用96 孔板结晶紫染色法。添加精油到一定浓度的菌液中，使其最终给药质量浓度分别为200、400、800、1 600 μg/mL，在37 ℃厌氧条件下培养6 d，弃去上层浮游细胞，用无菌水洗涤后加入甲醇固定10 min，移去后风干5 min，用0.1%结晶紫对生物膜进行染色20 min，移除并加入95%乙醇脱色15 min，取脱色液100 μL 于空白96 孔板，用酶标仪在570 nm 波长处测定吸光度，以未添加精油对照组的生物膜形成为100%，对各实验组生物膜形成百分比进行计算［15］。

2.2.3 细菌细胞内DNA、RNA 泄露实验测定 参考陈嘉丽等［16］报道并稍加改动，给药组为山苍子精油（质量浓度为“2.2.2” 项下），对照组为0.1%吐温80 溶液，2 组与细菌共培养1、2 h 后检测培养基中DNA 和RNA。

2.2.4 Annexin V-FITC/PI 双标记实验 收集对数生长期的细菌，加入精油-吐温溶液 （质量浓度为 “2.2.2” 项下），180 r/min 培养8 h 后离心，用PBS 缓冲液冲洗3 次，将菌悬液浓度稀释为1.0×106CFU/mL，取100 μL，按照Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪进行检测。

2.3 山苍子精油对细菌释放脂肪酶影响 痤疮丙酸杆菌（1×109CFU/mL） 与质量浓度为400、200 μg/mL 的精油-吐温80 溶液共培养，对照组与之前相同。在37 ℃、180 r/min厌氧条件下培养8 h 后离心取上清液，用脂肪酶试剂盒Lipase assay kit 检测其脂肪酶的含量变化。

2.4 统计学分析 利用GraphPad Prism 8 软件进行计算并作图，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 山苍子精油主要成分MIC 表1 显示，各成分MIC 依次为α-松油醇、β-月桂烯＜4-萜烯醇、α-侧柏烯与桧烯＜芳樟醇＜β-蒎烯＜柠檬醛。

3.2 细菌表面疏水性测定 对照组的初始疏水性指数为37.78%，精油干预后其随给药质量浓度增加而降低（P＜0.01），分别为20.99%、10.94%、7.35%，见图1。

图1 山苍子精油对痤疮丙酸杆菌表面疏水性的影响（n＝9）

3.3 生物膜形成测定 精油抑制痤疮丙酸杆菌生物膜形成（P＜0.01），并且随着给药质量浓度增加分别减少至48.95%、75.97%、76.97%、80.73%，见图2。

图2 山苍子精油对痤疮丙酸杆菌生物膜形成的影响（n＝12）

3.4 DNA 和RNA 泄露实验 精油干预1 h 后，上清液中DNA 含量随给药质量浓度增加而升高，分别是对照组的12.3、19.2、18.9、32.5 倍； 精油干预2 h 后，DNA 含量分别是对照组的18.4、25.4、25.9、34.1 倍，RNA 在培养基中的渗漏情况与DNA 基本一致，表明精油增加了细菌细胞膜的通透性（P＜0.01），并呈浓度和时间依赖性，见图3。

图3 山苍子精油对痤疮丙酸杆菌细胞膜通透性的影响（n＝9）

3.5 Annexin V-FITC/PI 双标记法 利用FITC 标记的Annexin-V 与PI 进行双染色，图中4 个象限Q1～Q4 分别代表坏死细胞和碎片、死细胞、受伤细胞和活细胞。与对照组比较，精油干预后受伤细胞数量增加（P＜0.05），并且呈浓度依赖性； 为200 μg/mL 时，受伤细胞数量无明显变化（P＞0.05），见图4。

图4 山苍子精油对痤疮丙酸杆菌Annexin V-FITC/PI 双标记的影响（n＝3）

3.6 脂肪酶活性测定实验 与对照组比较，添加了精油的培养基中脂肪酶随着给药质量浓度增加而减少（P＜0.01），分泌量分别减少78.6%、88.8%，见图5。

图5 山苍子精油对痤疮丙酸杆菌脂肪酶分泌的影响（n＝9）

4 讨论

痤疮是目前全球最常见的慢性皮肤病之一，据统计，全球有80%以上的人曾经或者现在正在受到该疾病的影响，其成因非常复杂，目前普遍认为是由过度角化、皮脂分泌、炎症介质释放及痤疮丙酸杆菌皮脂腺定植导致的［17-18］。作为诱发痤疮的重要菌株，痤疮丙酸杆菌一直是研究热点。与其他细菌一样，由于存在缺乏新型抗生素、滥用抗生素等问题，天然产物被广泛应用于痤疮丙酸杆菌的治疗［19］。

山苍子挥发油是一种使用历史悠久的芳香精油，很多研究表明，该精油对多种革兰氏阳性、阴性菌均有很好的抑菌活性［10］。根据课题组前期对山苍子精油药敏活性筛选实验发现，其对痤疮丙酸杆菌有较好抑制作用。目前未见有关山苍子精油各成分的抗痤疮丙酸杆菌活性的研究报道，故本实验评估了该精油各成分的抗菌效果，发现柠檬醛作为山苍子精油主要成分（超过50%），其对痤疮丙酸杆菌抑菌活性较好（MIC 为800 μg/mL）； 其他含量较低的成分，如α-松油醇、β-月桂烯、4-萜烯醇、α-侧柏烯、桧烯、芳樟醇、β-蒎烯，均对该菌表现出较好的抑制作用。

痤疮丙酸杆菌与金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌一样，都属于革兰氏阳性菌。本实验发现山苍子精油会破坏痤疮丙酸杆菌的细胞膜，造成细胞内重要生物大分子的外泄，这与之前报道的该精油对其他阳性菌细胞膜破坏现象类似［20-21］。根据Higaki 等［22］研究表明，痤疮丙酸杆菌所释放的脂肪酶是诱发痤疮的重要致病因素。本实验发现山苍子精油对痤疮丙酸杆菌脂肪酶释放量有很好的抑制作用，精油在对细菌细胞无显著性损伤的质量浓度（200 μg/mL） 下即可显著抑制脂肪酶活性，说明精油可能通过抑制该毒力酶的分泌而降低诱发痤疮的可能性。

综上所述，山苍子精油可能是通过破坏痤疮丙酸杆菌生物膜及减少毒力酶的分泌，降低其诱导感染的能力。此外，该精油中的主要成分柠檬醛及其他含量较低的次要成分也有助于其抗痤疮丙酸杆菌。