基于网络药理学和动物实验探讨牡丹皮提取物对接触性皮炎的改善作用

叶佳丰，韩婕珺，龚天贵，王 斌，陈 贤，王春丽*

（1.华东理工大学药学院，上海 200237； 2.美出莱化妆品有限责任公司，浙江 杭州 311121； 3.广州伽能生物科技有限公司，广东 广州 511335）

变应性接触性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）是一种迟发型超敏反应，分为致敏期和激发期［1-2］，是皮肤或黏膜接触外源性物质后发生的过敏性炎症反应，常在接触部位甚至它处发生。除了临床常用的皮质类固醇和抗组胺药，中药对接触性皮炎也有较好的疗效，如苦木［3］、地肤子［4］、阴地蕨［5］等。

牡丹皮为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，性微寒，味辛、苦，归心、肝、肾经，功效清热凉血、活血化瘀，具有抗炎、抗肿瘤、降糖、抗过敏、保护心血管等作用［6］。丹皮酚是牡丹皮中的主要作用成分，也是皮炎、湿疹的有效治疗药物。牡丹皮提取物具有治疗接触性皮炎的潜力，且机制尚不明确。

本研究采用网络药理学的方法对牡丹皮提取物治疗接触性皮炎的作用机制进行探究，对牡丹皮提取物治疗接触性皮炎效果进行了简单评价，并对其作用机制进行初步的验证，为牡丹皮提取物开发外用抗炎舒缓的药品或化妆品提供参考。

1 材料

1.1 动物 SPF 级ICR 小鼠20 只，体质量18～20 g，购自上海必凯科翼生物科技有限公司 ［动物生产许可证号SCXK （沪） 2018-0006］，于室温20 ～25 ℃、相对湿度40% ～60%、12 h/12 h 明暗交替的动物房内适应性喂养1周。动物实验经华东理工大学实验动物伦理委员会批准（伦理号ECUST-2021-03007）。

1.2 药物 牡丹皮购自北京同仁堂股份有限公司，经华东理工大学药学院马磊教授鉴定为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.的干燥根皮，其提取物的制备方法参考文献［7］ 报道。复方醋酸地塞米松乳膏（华润三九医药股份有限公司，批号2102019X）。

1.3 试剂 1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB） （东京化成工业株式会社，批号WT6CA-VO）； BCA 总蛋白定量试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号O20HR198586）； 小鼠白细胞介素6 （IL-6） ELISA 试剂盒（北京冬歌博业生物科技有限公司，批号202210）； β-actin、ERK1/2 抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号GB15001、GB11560）； p-ERK1/2 （美国Cell Signaling Technology 公司，货号4370）；p-Akt （上海碧云天生物技术有限公司，货号AA329）。

1.4 仪器 正置白光拍照显微镜（日本Nikon 公司，型号Eclipse Ci-L）； 酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司，型号RT-6100）； 台式高速冷冻离心机（北京大龙兴创实验仪器有限公司，型号D3024R）； 研磨仪、脱色摇床、垂直电泳仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号KZ-III-F、DS-2S100、SVE-2）； 转印电泳仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号SVT-2）； 超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司，型号JY92-11N）； 化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司，型号6100）； 荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司，型号CFX Connect）； PCR 仪（北京东胜创新生物科技有限公司，型号ETC811）。

2 方法

2.1 分组、造模与给药 小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组和牡丹皮组，每组5 只。采用DNCB 诱导建立接触性皮炎模型［8］，并适当改进，实验前1 d 对小鼠腹部及背部去毛，第1 天和第2 天上午9： 00 在下腹部2 cm×2 cm脱毛部位处均匀涂抹含5% DNCB 的乙醇50 μL 致敏； 第6天开始，在小鼠尾基底部以上1 cm 处的背部脱毛部位（2 cm×2 cm） 涂抹含1% DNCB 的乙醇25 μL 激发，每3 d 1 次，共4 次，均在上午9： 00进行。从致敏日起预防给药，给药面积2 cm×2 cm，每天1 次，至激发结束，均在下午5： 00 进行。牡丹皮组给予0.5%牡丹皮提取物0.2 mL，阳性药组给予醋酸地塞米松乳膏0.2 g，各组均匀涂抹至没有液体残留，并采用无刺激胶布固定以防止小鼠舔舐。

2.2 取材 末次给药24 h 后，脱颈处死小鼠，取给药部位皮肤2 cm×2 cm，平均分成1 cm×1 cm 的4 份，左上部分用于HE 染色，左下部分用于ELISA 检测，右上部分用于Western blot 实验，右下部分用于RT-qPCR 检测。

2.3 脾脏、胸腺指数检测 小鼠脱颈处死后，测定体质量，解剖取脾脏及胸腺并测定其质量，脾脏、胸腺指数以脾脏、胸腺质量与体质量的比值表示。

2.4 HE 染色观察皮肤组织病理形态 取各组小鼠皮肤组织，用4%多聚甲醛固定，经乙醇脱水、石蜡包埋切片后用苏木精-伊红染色后脱水、透明、封片，于显微镜下观察皮肤组织结构形态及炎细胞浸润情况。

2.5 ELISA 法检测皮肤组织IL-6 水平 取各组小鼠皮肤组织，用预冷的PBS （pH 7.4） 冲洗，去除残留血液，并用加有蛋白酶抑制剂的PBS 匀浆，反复冻融后于4 ℃、5 000×g下离心10 min，取上清，利用BCA 法测定总蛋白含量，按照试剂盒说明书操作，于450 nm 波长处测定各孔光密度（OD） 值，计算IL-6 水平。

2.6 网络药理学研究

2.6.1 牡丹皮成分的获取及筛选 通过TCMSP 数据库（https： //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以牡丹皮为搜索对象收集相关成分并进行筛选，标准为分子量（MW） ≤500、脂水分配系数（AlogP） 1 ～3［9］，得到符合要求的透皮吸收成分。由于类药性低并不代表没有药效，如丹皮酚的类药性值为0.04，依然有较好的药理活性，因此不考虑类药性的筛选。

2.6.2 潜在作用靶点的收集 通过TCMSP 收集各活性成分的靶点信息，并将 Swisstarget Prediction 数据库（http： //www.swisstargetprediction.ch/） Probability≥0.1、TargetNet 数 据 库 （ http： //targetnet.scbdd.com/）Probability ≥0.9、PharmMapper 数据库 （ http： //www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/） Probability≥0.5 的高分预测靶点纳入活性成分靶点中，将蛋白名用UniProt 蛋白质数据库 （https： //www.uniprot.org/） 转换为相应的 gene symbol，并通过DisGeNET 数据库（https： //www.disgenet.org/）、GeneCards 数 据 库 （ https： //www.genecards.org/）、TTD 数据库 （http： //db.idrblab.net/ttd/） 以“contact dermatitis” “allergic contact dermatitis” 为关键词收集接触性皮炎靶点信息，取各数据库靶点信息的并集作为最终的疾病靶点集。活性成分靶点与疾病靶点的交集即为牡丹皮提取物治疗接触性皮炎的潜在作用靶点。

2.6.3 活性成分-潜在作用靶点网络图的构建 整理活性成分信息及潜在作用靶点信息，得到对应的Network 及Type 文件，导入Cytoscape 3.8.0 软件，构建活性成分-潜在作用靶点网络图。

2.6.4 蛋白-蛋白相互作用 （PPI） 网络图的构建 在STRING 平台（https： //cn.string-db.org/） 导入潜在作用靶点信息，限定物种“Homosapiens”，选择最高置信度0.900，隐藏游离节点，获得潜在作用靶点蛋白的互作关系，导出为TSV 格式文件，并导入Cytoscape 3.8.0 软件，构建PPI 网络图。再利用cytoHubba 插件工具计算节点的拓扑参数。

2.6.5 GO、KEGG 富集分析 利用生物学信息注释数据库DAVID 数据库（https： //david.ncifcrf.gov/） 进行基因本体（gene ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 富集分析，以揭示牡丹皮提取物外用治疗接触性皮炎的生物进程、细胞组分、分子功能及相关通路情况。

2.6.6 Reactome 信号通路富集分析 在Reactome Pathway数据库 （Reactome Pathway Database，https： //reactome.org/） 中导入潜在作用靶点信息，限定物种为 “Homo sapiens”，进行通路富集分析。

2.6.7 分子对接验证 在Protein Data Bank 数据库（https： //www.rcsb.org/） 中，筛选解析度＜3Å 的靶点蛋白，得到对应的PDB 格式文件。并从PubChem 数据库（https： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下载活性成分3D 结构SDF 文件，通过Open Babel 2.4.1 转换为PDB 格式［10］。使用AutoDock Vina 1.1.2 进行分子对接，Autodock Tool 1.5.6 对关键靶点进行包括去水、加氢、去配体等预处理，测定小分子扭转键，导出蛋白及配体的pdbqt 文件。随后将配体与处理后的蛋白对接，并用PyMOL 2.3.4 处理对接结果，通过结合能判断活性成分与靶点蛋白结合效果［11］。

2.7 Western blot 法检测皮肤组织p-ERK1/2、p-Akt 蛋白表达 取各组小鼠皮肤组织，匀浆裂解得到总蛋白，使用BCA 法进行蛋白定量，经电泳分离、转膜后5%脱脂牛奶室温封闭30 min，加一抗4 ℃摇床孵育过夜，加二抗孵育30 min，加入ECL 发光液进行化学发光检测。采用Image J分析图像条带灰度值。

2.8 RT-qPCR 法检测皮肤组织PI3KmRNA 表达 取各组小鼠皮肤组织，用RNA 提取液提取总RNA，逆转录合成cDNA 后进行PCR 扩增，反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，循环40 次。采用2-ΔΔCT法进行数据处理。GAPDH正向引物序列 5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′，反向引物序列 5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′；PI3K正向引物序列5′-CACGGCGATTACACTCTTACACTA-3′，反向引物序列5′-CACTGGGTAGAGCAACTTCACATC-3′。

2.9 统计学分析 通过IBM SPSS Statistics 26 和Graph Pad 8.4.3 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 牡丹皮提取物对小鼠皮肤组织病理的影响 如图1 所示，模型组小鼠皮肤出现明显的结痂、潮红，伴有皮肤粗糙破损； 与模型组比较，阳性药组及牡丹皮组小鼠皮肤结痂消失，少见皮肤潮红，皮肤状态优于模型组。HE 染色结果显示，与空白组比较，模型组表皮重度增厚（黑色箭头），角质层增厚，可见脓性灶（紫色箭头）； 表皮局部缺失，真皮裸露（红色箭头）； 真皮胶原纤维排列紊乱，真皮及皮下可见大量的淋巴细胞、粒细胞呈弥散性浸润（蓝色箭头）。与模型组比较，阳性药组及牡丹皮组小鼠皮肤组织皮肤结构完整，淋巴细胞浸润较少（蓝色箭头）。

图1 各组小鼠皮肤形态及HE 病理染色

3.2 牡丹皮提取物对小鼠脾脏、胸腺指数的影响 如表1所示，与空白组比较，模型组小鼠脾脏指数升高 （P＜0.01），显示超敏反应发生； 与模型组比较，阳性药组及牡丹皮组小鼠脾脏指数降低（P＜0.05，P＜0.01）。与空白组比较，模型组小鼠胸腺指数降低（P＜0.01）； 与模型组比较，牡丹皮组小鼠胸腺指数升高（P＜0.01），而阳性药组小鼠胸腺指数降低（P＜0.05）。

表1 各组小鼠脾脏指数、胸腺指数比较（mg/10 g，±s，n＝5）

表1 各组小鼠脾脏指数、胸腺指数比较（mg/10 g，±s，n＝5）

组别脾脏指数胸腺指数空白组39.35±3.5236.68±0.38模型组49.18±1.52＃＃22.30±1.78＃＃阳性药组15.36±1.95**19.50±0.66*牡丹皮组42.70±0.83*29.51±1.48**

3.3 牡丹皮提取物对小鼠皮肤组织IL-6 水平的影响 如图2 所示，与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织IL-6 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组及牡丹皮组小鼠皮肤组织IL-6 水平降低（P＜0.01）。

图2 各组小鼠皮肤组织IL-6 水平比较（±s，n＝5）

3.4 牡丹皮提取物的活性成分 从TCMSP 数据库中筛选得到牡丹皮活性成分18 种。如表2 所示，这些化合物具有较小的分子量及较好的透皮性质，可作为后续研究的有效成分。

表2 牡丹皮有效成分信息

3.5 牡丹皮提取物的潜在作用靶点 通过多个数据库收集各活性成分的靶点信息，去除重复项共得到628 个靶点。从DisGeNET 数据库、GeneCards 数据库、TTD 数据库收集疾病靶点，去除重复项，得到靶点信息共2 317 条。使用Venny 2.1.0 平台（https： //bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/） 取活性成分靶点和疾病靶点的交集，得到潜在作用靶点共317 个，见图3。

图3 活性成分靶点-接触性皮炎靶点Venn 图

3.6 牡丹皮提取物活性成分-潜在作用靶点网络图 如图4所示，活性成分与潜在作用靶点网络图包含336 个节点（1个药、18 种成分、317 个靶点）、1 380 条边。槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422） 可结合靶点较多，分别为199、132 个。

图4 活性成分-潜在作用靶点网络图

3.7 PPI 网络分析 PPI 网络图（图5） 反映了靶点之间的联系，共含270 个节点（47 个游离节点）、1 423 条边，各靶点的拓扑参数可反映1 个靶点对PPI 网络的影响［12］。该网络图中颜色表示度值（Degree），字体大小表示紧密度（Closeness），节点大小表示介度 （Betweenness），取Degree、Closeness、Betweenness 前15 位的靶点作为关键靶点［13］。表3 显示，牡丹皮外用治疗接触性皮炎主要作用于原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、有丝分裂原激活的蛋白激酶1 （MAPK1）、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚单元α（PIK3R1） 等关键靶点。

表3 关键靶点拓扑参数

图5 潜在作用靶点PPI 网络图

3.8 GO、KEGG 富集分析 如图6 所示，GO 富集分析得到显著性P＜0.05 的生物进程（biological process，BP） 条目892 条，细胞组分（cellular component，CC） 条目88 条，分子功能（molecular function，MF） 条目112 条。牡丹皮外用治疗接触性皮炎的生物进程主要涉及对药物的反应（response to drug）、对脂多糖的反应 （ response to lipopolysaccharide）、炎症反应（inflammatory response） 等，细胞组分主要涉及在细胞外空间（extracellular space）、膜筏（membrane raft）、胞液（cytosol） 等，分子功能主要涉及在酶结合（enzyme binding）、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity） 等。

图6 潜在作用靶点GO、KEGG 富集分析图

KEGG 信号通路富集分析得到显著性P＜0.05 的条目共177 条。潜在作用靶点显著富集于PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK 信号通路 （MAPK signaling pathway） 等［1-2，14］，表明牡丹皮提取物可能通过PI3K-Akt、MAPK 信号通路发挥治疗接触性皮炎的作用。

3.9 Reactome 信号通路富集分析 Reactome 信号通路富集共得到P＜0.05 条目1 427 条，如图7 所示，潜在作用靶点显著富集于信号转导 （signal transduction）、免疫系统（immune system）、免疫系统中的细胞因子信号（cytokine signaling in immune system） 等，表明PI3K-Akt 信号通路的传导可能在牡丹皮提取物治疗接触性皮炎中发挥重要作用。

图7 Reactome 信号通路富集分析结果

3.10 分子对接验证 关键成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate）、5- ｛ ［5- （4-methoxyphenyl） -2-furyl］ methylene｝ barbituric acid、儿茶素［（＋） -catechin］ 与关键靶点SRC （1A07）、MAPK1 （3SA0）、PIK3R1 （1H9O）、HSP90AA1 （1BYQ）、TP53 （3Q01） 分子对接验证的结果见图8，可知结合能均小于-5.0 kcal/mol［15］，表明槲皮素、山柰酚等成分与靶点各靶点都具有较好的结合活性。

图8 分子对接结果热图及对接模式图

3.11 牡丹皮提取物对小鼠皮肤组织p-ERK、p-Akt 表达的影响 如图9 所示，与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织p-ERK1/2、p-Akt 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组及牡丹皮组小鼠皮肤组织p-ERK1/2、p-Akt蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图9 各组小鼠皮肤组织p-ERK、p-Akt 蛋白表达比较（±s，n＝5）

3.12 牡丹皮提取物对小鼠皮肤组织PI3KmRNA 表达的影响 如图10 所示，与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织PI3KmRNA 表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组及牡丹皮组小鼠皮肤组织PI3KmRNA 表达升高（P＜0.01）。

图10 各组小鼠皮肤组织PI3K mRNA 表达降低（±s，n＝5）

4 讨论

接触性皮炎发病机制复杂，这是一种由多种细胞因子介导的免疫细胞应答反应，包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素等［16-17］。本研究动物实验结果显示，牡丹皮提取物可以降低小鼠皮肤组织的炎细胞浸润及IL-6 水平，维持皮肤组织结构； 牡丹皮提取物给药可以降低模型小鼠的脾脏指数，减轻过敏反应，表明牡丹皮提取物可以有效缓解小鼠接触性皮炎的症状。此外，IL-6 可以影响MAPK 信号通路，调节细胞应激和凋亡［18］。本研究网络药理学分析显示，牡丹皮提取物中的18 种活性成分通过调节多种生物进程，发挥多种分子功能发挥改善接触性皮炎的作用，包括免疫应答和对脂多糖的反应［2，19］等； 其次牡丹皮提取物还可以调节包括PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路在内的多个通路，这些通路与免疫炎症调节有重要关系［20-22］。

MAPK、PI3K-Akt 信号通路在调节细胞生长代谢、增殖分化中发挥着重要的作用［23-24］。MAPK1 编码的MAP 激酶1（ERK2） 通过MAPK/ERK 信号通路依赖的机制被细胞外信号激活，调控细胞的增殖凋亡等生理活动。PI3K/Akt 信号通路可介导炎症反应，与多种炎性介质密切相关［25］，其中Akt 是PI3K 通路的中心介质，其C 端调节区的Ser473 位点对Akt 的完全激活起着重要作用［26］。研究表明，激活ERK1/2 可以减少心肌细胞凋亡［27］，减轻大鼠脑缺血诱导的炎症反应［28］。同时有研究指出，激活PI3K-Akt 信号通路可以减轻前列腺素诱导的氧化应激及炎症水平，抑制自噬，减轻细胞损伤及凋亡［29］。本研究结果显示，牡丹皮提取物可以提高接触性皮炎小鼠皮肤组织p-ERK、p-Akt 蛋白表达及PI3KmRNA 表达，激活了MAPK/ERK、PI3K-Akt 信号通路，发挥炎症抑制的作用。

综上所述，本研究表明，牡丹皮提取物可以降低接触性皮炎小鼠皮肤组织IL-6 水平，改善皮肤状态，调节小鼠脾脏、胸腺指数； 其次通过网络药理学和分子对接探讨了牡丹皮提取物治疗接触性皮炎的机制，并进行了简单的实验验证。验证结果也表明，牡丹皮提取物可通过提高p-ERK1/2 表达激活MAPK/ERK 通路，提高p-Akt 蛋白表达及PI3KmRNA 表达，激活PI3K-Akt 信号传导发挥炎症抑制的作用。MAPK/ERK、PI3K-Akt 信号通路可能是牡丹皮提取物治疗接触性皮炎的关键信号通路。详细的通路传导机制有待进一步的验证。