香砂六君子汤对脾虚型IBS-D 大鼠肠道菌群及其代谢产物SCFAs 的调节作用

张远哲，黎豫川，杨元凤，陈礼大，罗玉玲

（1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025； 2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550025）

肠易激综合征（imitable bowel syndrome，IBS） 是一种肠道功能紊乱性疾病［1］，主要分为便秘型（IBS-C）、腹泻型（IBS-D）、混合型（IBS-M）、非典型肠易激综合征［2］，其中IBS-D 的发病率约占IBS 患者的40%以上，治疗后易反复，给患者的心理及经济带来负担。研究表明，IBS-D发生与饮食、心理因素、遗传及肠道菌群紊乱等因素密切相关［3］，患者普遍存在肠道菌群紊乱现象，表现为部分有益菌减少、致病菌增多［4］。短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs） 是肠道微生物作用与机体免疫功能的一种介质，肠道菌群能够利用SCFAs 作用于肠嗜铬细胞，调控5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT） 的合成和释放，从而影响肠动力及敏感性［5］。目前治疗IBS-D 主要以抗感染、促进肠道菌群平衡为主，短期效果佳，但长期易产生较多副作用，停药后易复发［6］。香砂六君子汤由六君子汤演变而来，具有益气健脾化湿之效，是临床治疗脾虚湿阻的常用方，能有效调节脾虚型IBS-D 大鼠肠动力，但其具体机制尚不清楚［7］，故本研究通过建立脾虚型IBS-D 大鼠模型，探讨香砂六君子汤对IBS-D 大鼠肠道菌群及其代谢产物SCFAs 的影响，为相关治疗提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 36 只雄性SPF 级SD 大鼠，体质量（200±20） g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK （川） 2021-0037，饲养于贵州中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证号SYXK （黔） 2021-0005。本实验获得贵州中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准号20210042），操作严格按照3R 准则。大鼠置于安静环境中适应性饲养1 周，给予充足、清洁的饮水。

1.2 药物 香砂六君子汤由人参3 g、茯苓6 g、生白术6 g、生甘草2 g、陈皮2.5 g、生半夏3 g、砂仁2.5 g、木香2 g、生姜6 g 组成，混合煎煮2 次，第1 次加8 倍量水，武火煮开后文火煎煮30 min； 第2 次加6 倍量水，武火煮开后文火煎煮20 min，合并2 次滤液，100 ℃水浴浓缩至1 g/mL，4 ℃保存。依据人与大鼠体表面积系数法，得出大鼠给药剂量为每天2.9 g/kg。复合乳酸菌购自江苏美通制药有限公司（国药准字H19980184）。

1.3 试剂与仪器 甲醛购自四川西陇科学有限公司（批号1340040101602）； 苏木素染液购自武汉赛维尔生物科技有限公司（批号G1004）； 伊红染液购自合肥博美生物科技有限责任公司（批号YE2080）； Rat 5-HT ELISA 试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司 （批号ZC-35959）； TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 购自美国Illumina 公司（批号NP1011001）； 高灵敏度DNA 分析试剂盒购自美国安捷伦公司（批号50674626）。数码三目摄像显微镜购自麦克奥迪实业集团有限公司（型号BA210Digital）； Hiseq 测序仪购自美国Illumina 公司（型号2500）； 紫外分光光度计（型号Evolution 200）、质谱仪（型号ISQ 7000 质谱仪）、气相色谱仪（型号Trace 1300） 均购自美国赛默飞世尔科技公司。

2 方法

2.1 模型建立及给药 大鼠随机分为对照组，模型组，香砂六君子汤低、中、高剂量组，复合乳酸菌组。除对照组外，其余各组大鼠灌胃给予100%番泻叶水煎剂（生药量1 g/mL） 10 mL/kg，采取弹力绷带束缚其两前肢和肩背部，限制其上半身活动，时长2 h，束缚期间联合给予夹尾刺激，每次约3～5 min，每天2 次，连续14 d，可见大鼠出现腹泻、体质量减轻、神态萎靡、食少纳呆、困倦等症状，而且根据AWR 评分标准对模型进行验证。香砂六君子汤低、中、高剂量组灌胃给予0.2 mL 质量浓度分别为0.145、0.29、0.58 g/mL 的香砂六君子汤水煎液，复合乳酸菌组每天灌胃给予0.2 mL 0.026 g/mL 复合乳酸菌混悬液，对照组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水，每天1 次，连续14 d。

2.2 粪便性状评分及粪便含水量检测 观察大鼠毛色、精神状态、进食状态、粪便性状及形态，采用布里斯托大便分类法对大便性状进行评分。收集24 h 内大鼠粪便，计数并称定质量，得到粪便湿重，烘干后再次称定质量，获得粪便干重，计算粪便含水量，公式为含水量＝ ［（粪便湿重-粪便干重） /粪便湿重］ ×100%。

2.3 腹壁撤退反射实验（AWR） 检测内脏敏感性 在造模和给药结束后，采用球囊扩张直肠。大鼠固定后，将有气囊的导尿管前端用石蜡润滑后插入肛门，后端连接注射器，待大鼠适应后经导尿管注射温盐水进行扩张，记录出现弓背和腹部抬起的最小容量阈值。

2.4 炭末推进实验检测肠运输速率 治疗后，各组大鼠灌胃给予2 mL 炭末混悬液，40 min 后处死，并对肠系膜进行分离，测量幽门至炭末前沿的距离，即炭末在小肠中推进距离，计算炭末推进率，公式为炭末推进率＝ （炭末在小肠中的推进距离/小肠总长度） ×100%。

2.5 HE 染色检测结肠病理变化 收集大鼠结肠组织，用10%中性甲醛固定，乙醇脱水后石蜡包埋，切片，脱蜡，HE 染色，封片，用显微镜观察组织形态结构变化并拍照，根据大鼠结肠组织损伤评分标准（表1） 进行评分。

表1 大鼠结肠组织损伤评分标准

2.6 ELISA 法检测大鼠血清5-HT 水平 严格按照试剂盒说明书操作，在450 nm 波长处检测光密度（OD） 值，计算大鼠血清5-HT 水平。

2.7 16S rRNA V3-V4 肠道菌群测序 收集大鼠粪便，DNA 提取试剂盒提取总DNA，Nanodrop 定量DNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量，加入引物进行PCR 扩增，引物序列为正向 ACTCCTACGGGAGGCAGCA，反向GGACTACHVGGGTWTCTAAT。将PCR 扩增回收产物进行荧光定量，TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库，高灵敏度DNA 试剂盒进行质量检测，在Illumina HiSeq 平台进行测序。

2.8 GC-MS 法对大鼠肠道粪便中SCFAs 浓度分析 取适量大鼠粪便于1.5 mL 离心管中，加500 μL 水和100 mg 玻璃珠，匀浆1 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清液200 μL，加入100 μL 15%磷酸、20 μL 375 μg/mL 4-甲基戊酸溶液和280 μL 乙醚匀浆1 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，即得供试品溶液。质谱条件为Agilent HP-INNOWAX 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 进样量1 μL，分流比10 ∶1； 进样口温度250 ℃； 离子源温度300 ℃； 传输线温度50 ℃； 程序升温 （初始90 ℃，10℃/min升至120 ℃，5 ℃/min 升至150 ℃，25 ℃/min 升至250 ℃，维持2 min）； 载气气体氦气，体积流量1.0 mL/min； 电子轰击电离 （EI） 源； SIM 扫描； 电子能量70 eV。

2.9 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠一般状态、粪便性状及粪便含水率的影响 对照组大鼠精神良好、毛色光滑，粪便呈颗粒状； 模型组大鼠出现精神萎靡、扎堆、腹泻、毛色杂乱晦暗。与对照组比较，模型组大鼠布里斯托大便分类法评分、粪便含水量升高（P＜0.01）； 与模型组比较，香砂六君子汤高剂量组和复合乳酸菌组大鼠布里斯托大便分类法评分、粪便含水量降低（P＜0.01），见图1。

图1 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠粪便性状、粪便含水率的影响（±s，n＝6）

3.2 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠结肠动力、内脏敏感性的影响 与对照组比较，模型组大鼠疼痛阈值降低 （P＜0.01）； 与模型组比较，香砂六君子汤各剂量组和复合乳酸菌组大鼠疼痛阈值升高（P＜0.05，P＜0.01），表明香砂六君子汤干预后大鼠的内脏敏感性降低，见图2A。与对照组比较，模型组大鼠肠道推进率升高（P＜0.01）； 与模型组比较，香砂六君子汤中、高剂量组和复合乳酸菌组大鼠肠道推进率降低（P＜0.01），见图2B。

图2 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠结肠动力、内脏敏感性的影响（±s，n＝6）

3.3 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠结肠组织病理改变的影响 与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中可见黏膜上皮分离、脱落、坏死，以及少量炎性细胞浸润和纤维组织增生； 与模型组比较，香砂六君子汤组和复合乳酸菌组大鼠结肠组织黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层结构较完整，黏膜上皮细胞完整，未见炎性细胞浸润和纤维组织增生，见图3A。与对照组比较，模型组大鼠结肠组织损伤评分升高（P＜0.01）； 与模型组比较，香砂六君子汤中、高剂量组和复合乳酸菌组大鼠结肠组织损伤评分降低（P＜0.01），见图3B。

图3 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠结肠组织病理改变的影响（HE，×400，±s，n＝6）

3.4 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠血清中5-HT 水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清5-HT 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，香砂六君子汤各剂量组和复合乳酸菌组大鼠血清5-HT 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），见图4。

图4 香砂六君子汤对大鼠血清5-HT 水平的影响（±s，n＝6）

3.5 16S rRNA V3-V4 肠道菌群测序

3.5.1 各组大鼠粪便菌群门、属水平分析 大鼠粪便菌群组成在门水平上以厚壁菌门 （Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes） 和变形菌门（Proteobacteria） 为主，与模型组比较，香砂六君子汤组厚壁菌门相对丰度升高，拟杆菌门丰度降低，见图5A。大鼠粪便菌群组成在属水平上以乳杆菌属（Lactobacillus）、普雷沃菌属（Prevotella） 和瘤胃球菌属（Ruminococcus） 为主，与对照组比较，模型组普雷沃菌属相对丰度降低； 与模型组比较，香砂六君子汤组和复合乳酸菌组乳杆菌属和普雷沃菌属相对丰度升高，见图5B。

图5 各组大鼠粪便肠道菌群门、属水平分类图（n＝3）

3.5.2 菌群多样性分析 如图6 所示，与对照组比较，模型组Chao1、Observed-Species、shannon 指数均呈升高趋势，而Goods-coverage 指数降低； 与模型组比较，香砂六君子汤组和复合乳酸菌组Chao1、Observed-Species、shannon 指数降低，Goods-coverage 指数升高。通过PCoA 在加权UniFrac距离矩阵上评估Beta 多样性，结果见图7，可知模型组样本菌落组成差异较大，香砂六君子汤、复合乳酸菌等药物干预后菌落组成差异较小。

图6 Alpha 多样性指数的分组箱线图（n＝3）

图7 PCoA 分析的样本二维排序图（n＝3）

3.5.3 物种韦恩图分析 由图8 可知，各组间具有共有和单独的OTU 数量，4 个分组共有OTU 数目为140 个，对照组共有2 223 个OTU，模型组共有2 733 个OTU，香砂六君子汤组共有2 137 个OTU，复合乳酸菌组共有1 747 个OTU，模型组独有的OTU 数目最多，为2 027 个； 对照组独有1 687 个； 香砂六君子汤组和复合乳酸菌组分别独有1 470、1 134 个。

图8 大鼠肠道微生物ASV/OTU 维恩图（n＝3）

3.5.4 物种聚类的属水平物种组成 由图9 可知，与对照组比较，模型组大鼠粪便组织中黏液螺菌属（Mucispirillum）、安德克氏菌属（Adlercreutzia）、普雷沃菌属等相对丰度降低，考拉杆菌属 （Phascolarctobacterium）、密螺旋体属（Treponema） 相对丰度升高； 与模型组比较，香砂六君子汤组和复合乳酸菌组乳杆菌属、瘤胃球菌属、普雷沃菌属相对丰度升高。

3.5.5 差异菌群筛选 由图10 可知，对照组优势菌株是g_Bacteroides、f_Bacteroidaceae、g_Turicibacter、o_Turicibacterales、c_Actinobacteria、g_Paraprevotellaceae、Turicibacteraceae、Actinomycetales、Porphyromonadaceae，模型组优势菌株是f_S24_ 7，香砂六君子汤组优势菌株是P_Firmicutes，复合乳酸菌组优势菌株是f_Streptococcaceae、p_Verrucomicrobia、g_Akkermansia、p_Verrucomicrobiae、f_Micrococcaceae、Parabacteroides、Verrucom-icrobiales、Verrucomicrobiaceae、g_Streptococcus、g_Rothia。

图10 物种结构差异显著性分析的LEfSE 图（n＝3）

3.6 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量的影响 由图11 可知，与对照组比较，模型组大鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量降低（P＜0.05）； 与模型组比较，香砂六君子汤组和复合乳酸菌组大鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量升高（P＜0.05）。

图11 香砂六君子汤对IBS-D 大鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量的影响（±s，n＝6）

4 讨论

中医认为，IBS-D 属于“腹痛” “泄泻” 范畴，饮食不节、先天不足、后天失养、外感邪机等因素是造成IBS-D的主要病机［8］，基本特征为脾虚湿盛，病位在肠，主病之脏属脾，湿盛为标，脾虚为本，故益气健脾是治疗本病的基本治法［9］。香砂六君子汤经六君子汤加砂仁和木香衍变所得，由人参、茯苓、白术、甘草、陈皮、砂仁、半夏、木香及生姜组成，具有益气健脾、燥湿行气之功效。其中人参为君药，具有安神益智、补脾益肺的作用； 白术、茯苓为臣药，具有利水祛湿、健脾安神的功效； 半夏、陈皮、砂仁、木香为佐药，具有化痰止呕、理气健脾、温脾止泻、行气止痛，健脾消食等作用； 甘草为使药，具有补脾益气、调和众药的作用； 全方组合，主要发挥益气健脾化湿之效。本研究结果表明，香砂六君子汤干预后大鼠腹泻状况、粪便含水量、内脏敏感性、肠道推进率、外周血中5-HT 水平、炎性细胞浸润和纤维组织增生降低，表明它能减轻脾虚型IBS-D 的临床症状，具有较好的治疗作用。肠道菌群失调是导致IBS-D 发生发展的重要因素［10］，IBS-D 发生后肠道菌群中双歧杆菌、乳杆菌等数量降低，肠道杆菌升高，导致菌群多样性降低［11-12］，而造成肠道菌群失衡的因素主要包含肠道敏感性和通透性升高、炎症反应、胃肠动力改变和应激等因素，故维持肠道菌群的平衡是治疗IBS-D 的关键［13］。16S rRNA 结果显示，经过对各组菌群在门、属水平上的结构变化比较，与模型组比较，香砂六君子汤组菌群结构发生了显著变化，其中厚壁菌门和拟杆菌门分别具有抗炎和促炎作用，其比值的大小反应了肠道炎症水平［14］。乳杆菌属作为肠道中常见的一种有益菌，具有促进消化、保护消化道黏膜、维持肠道菌群平衡的作用［15］。普雷沃菌属是一种具有维持肠道正常生理功能的多形态杆菌，其数目的减少常预示着机体中生理代谢的失衡［16-17］。本研究结果显示，香砂六君子汤组大鼠粪便中厚壁菌门/拟杆菌门比值升高，乳杆菌属和普雷沃菌属含量及相对丰度升高，表明香砂六君子汤能够通过抗炎并维持消化道菌群平衡来维持肠道健康。

肠道菌群的代谢产物主要包含SCFAs、胆碱代谢物、脂类、维生素、多胺类等［18］，其中SCFAs 作为肠道微生物的重要代谢产物之一，在结肠中的抗性淀粉和纤维被厌氧菌发酵后生成，具有降低结肠pH、抑制病原菌繁殖等作用，主要包含乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸等［19-20］。近年来研究证实，SCFAs 能通过调控神经递质5-HT 来间接影响肠道菌群稳态。本研究结果表明，香砂六君子汤干预后能增加肠道粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量及SCFAs 水平，从而发挥治疗IBS-D 的作用。

综上所述，香砂六君子汤能够通过调节肠道菌群平衡，升高大鼠肠道粪便中SCFAs 浓度，从而减轻IBS-D 的症状。但本研究未深入阐明香砂六君子汤对肠道菌群调控的详细机制，后期将进一步加以阐述。