健心颗粒通过调控Apelin 通路对心力衰竭大鼠心室-动脉偶联的影响

欧阳秋芳，游 涛，许 荣，林 晴，严锦贤，陈永忠，李 滨，郭进建

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350001）

目前我国心力衰竭患者约450 万人，其中80%是老年人，约60%患者在确诊5 年内死亡。因此，心力衰竭已成为老年人死亡的主要原因。其临床综合征为左室功能紊乱后，左室泵功能和血管阻抗不匹配导致［1］。

心室-动脉脱偶联是心力衰竭发生发展的病理基础。心脏结构、功能状态影响外周动脉，而外周动脉通过改变负荷影响心脏。心脏和动脉树组成闭合环路，结构相互联系，功能相互偶联，这种心室与动脉系统之间的相互作用称为心室-动脉偶联（ventricular-arterial coupling，VAC）［2］。当心室与动脉的弹性匹配、功能偶联时，能使心脏的搏出功趋于最佳，效率最高。合理的匹配是心室和动脉间能量高效传输的重要保障。倘若心室-动脉脱偶联，则会导致心脏所做的功利用减少［3］。爱帕琳肽（Apelin） 是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的新成员，对维持心血管稳态偶联具有重要作用［4］。Apelin 通过活化下游血管紧张素1 型受体相关蛋白（angiotensin type 1 receptor related protein，APJ），激活一氧化氮信号通路，介导血管舒张。

健心颗粒是本院已获得专利的院内制剂，临床与基础实验均表明它治疗心力衰竭疗效显著［5-6］，但其是否通过活化Apelin/APJ、改善心室-动脉脱偶联来治疗心力衰竭目前尚无报道，故本实验对此进行研究。

1 材料

1.1 动物 18 月龄雄性大鼠60 只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （沪）2018-0006］，饲养于福建中医药大学动物实验研究中心SPF 级动物房［实验动物使用许可证号SYXK （闽） 2019-0007］，常规饲料饲养，自由饮水，适应性饲养2 周后开始实验。动物实验经福建中医药大学附属第二人民医院伦理委员会批准（伦理号FJPSPH-IAEC2019061）。

1.2 试剂与药物 健心颗粒组方药材（黄芪10 g、红参5 g、蒲黄3 g、丹参5 g、猪苓5 g、白术5 g、桂枝3 g、葶苈子5 g） 购自福建省药材有限责任公司，严格按照相关制剂及质量标准，由本院制剂室制成颗粒剂。Apelin 抗体（货号ab133624） 购自英国Abcam 公司； APJ 抗体（货号20341-1-AP） 购自美国Proteintech 公司； ［Pyr1］ -Apelin-13、F13A （货号217082-60-5、568565-11-7） 均购自美国Sigma 公司； Masson 三色染色试剂盒（货号G1340） 购自北京索莱宝科技有限公司。

2 方法

2.1 造模、分组与给药 除假手术组（12 只） 外，其余大鼠参考文献［7］ 报道，采用结扎冠状动脉左前降支建立左室心肌缺血模型，术后第7 天，以射血分数小于60%为心力衰竭模型成功建立的标志［8］，采用超声剔除未达到标准者。将造模成功的大鼠随机分为模型组、健心颗粒组（3.2 g/kg，折合生药量4.38 g/kg，相当于临床等效剂量，灌胃）、Apelin 组（200 μg/kg ［Pyr1］ -Apelin-13，腹腔注射）、健心颗粒＋F13A 组 （3.2 g/kg 健心颗粒灌胃＋200 μg/kg F13A 腹腔注射）； 假手术组穿线但不结扎冠状动脉，灌胃给予纯水。给药期间，观察大鼠活动度、精神状态、皮毛状况、体质量、心脏指数（心脏质量/体质量）等变化，干预12 周后检测血流动力学并取材。

2.2 心导管测量血流动力学 给药结束后，参考文献［9］ 报道测量心率、收缩压、舒张压、左室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室压力最大上升速率 （＋dP/dtmax）、左室压力最大下降速率 （-dP/dtmax）。

2.3 超声法测量脉搏波传导速度 采用超声仪无创测量脉搏波传导速度（pulse wave velocity，PWV），大鼠鼻尖至尾根部直线距离即体长L； 采用超声仪进行血流速度频谱的采集，并结合心电图进行测量颈-股脉搏波传播时间，为股动脉与颈总动脉脉搏波波起始点与心电图R 波顶点的时间间隔差，即TR-股动脉-TR-颈动脉［10］，计算大鼠主动脉PWV，公式为PWV＝ （0.461 4L＋1.833 5） /颈-股脉搏波传播时间。

2.4 心室-动脉偶联指数计算 给药结束后，参考文献［11］ 报道记录压力-容积曲线，计算有效动脉弹性Ea（Ea＝左室收缩末期压力/收缩末期容积）、左室收缩末弹性Ees ［左室收缩末期压力/（每搏输出量-非张力心室容积）］ 和心室-动脉偶联指数（Ea/Ees）。

2.5 胸主动脉环血管张力测定分析血管舒缩功能 参考文献［12］ 报道，取大鼠胸主动脉，用Power Lab 多通道生理信号采集处理系统描记张力变化，血管环舒张效应以该血管舒张张力绝对值与1.0×10-5mmol/L 去甲肾上腺素所引起血管收缩张力绝对值的比值（百分比） 表示，并计算最大舒张百分比，最大舒张效应用Emax表示。舒张反应敏感性用pD2值表示，表示EC50以10 为底的负对数值［产生50%最大效应（E＝1/2Emax） 的摩尔浓度的负对数］。

收缩功能检测： 给予100 μL 氯化钾（10～100 mmol/L）和去甲肾上腺素（1.0×10-10～1.0×10-4mol/L），记录血管收缩时相应的张力值。血管环收缩效应用血管收缩张力绝对值与氯化钾预收缩张力绝对值的比值表示，并计算最大收缩百分比。

舒张功能检测： 给予100 μL 去甲肾上腺素溶液（1.0×10-3mol/L） 预收缩血管，待血管收缩至最大幅度时累积给予乙酰胆碱或硝普钠溶液100 μL （1.0×10-10～1.0×10-4mol/L），用乙酰胆碱或硝普钠诱发的舒张率来分别评价内皮依赖性舒张或非依赖性舒张功能。

2.6 主动脉组织形态学观察 取大鼠降主动脉5 mm，于4%多聚甲醛中固定24 h，脱水浸蜡，石蜡包埋，制成4 μm 切片，脱蜡，Masson 复合染色分析主动脉胶原密度，Verhoeff 染色分析主动脉弹力纤维情况。

2.7 Western blot 法检测胸主动脉Apelin、APJ 蛋白表达取大鼠胸主动脉100 mg，剪碎，冰上裂解，离心取上清，蛋白定量后加热变性（50 μg），将其电泳分离并转移到PVDF 膜上，脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃孵育过夜，冲洗，二抗孵育，免疫印迹显色。用图像分析系统对图片进行灰度扫描，以GAPDH 为内参，进行半定量分析，以比值表示其相对表达。

2.8 血清Apelin、BNP、NO 水平检测 大鼠下腔静脉取血2 mL，室温静置30 min，3 000 r/min 离心，收集血清，用酶联免疫吸附 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 法检测Apelin、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP） 水平，硝酸还原酶法检测一氧化氮 （nitrogen monoxide，NO） 水平，均严格按照试剂盒说明书操作。

2.9 统计学分析 通过SPSS 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用LSD 法； 非正态分布资料采用Mann-WhitneyU检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 健心颗粒对心力衰竭大鼠一般情况的影响 假手术组死亡1 只； 模型组死亡5 只，死亡率为41.7%； 健心颗粒组和Apelin 组死亡3 只，死亡率为25%； 健心颗粒＋F13A组死亡4 只，死亡率为33.3%，存活8 只。假手术组大鼠饮食、活动正常，皮毛整洁，体质量增加，无心肌梗死情况； 与假手术组比较，模型组大鼠进食、活动明显减少，皮毛干燥无光泽，体质量降低（P＜0.05）； 与模型组比较，健心颗粒组体质量增加（P＜0.05），其作用与［Pyr1］ -Apelin-13 类似，见表1。

表1 健心颗粒对心力衰竭大鼠一般情况的影响（±s）

表1 健心颗粒对心力衰竭大鼠一般情况的影响（±s）

注： 与假手术组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与健心颗粒组比较，＆P＜0.05。

组别动物数/只体质量/g死亡数（死亡率/%）假手术组11588.34±35.731（8.3）模型组7516.69±69.33*5（41.7）健心颗粒组9565.17±45.16＃3（25.0）Apelin 组9557.42±47.69＃3（25.0）健心颗粒＋F13A 组8537.25±39.46＃4（33.3）

3.2 健心颗粒对心力衰竭大鼠心功能及血流动力学的影响如表2 所示，与假手术组比较，模型组心脏指数、心肌梗死面积和LVEDP 值升高（P＜0.05），±dP/dtmax值降低（P＜0.05），表明心力衰竭失代偿； 与模型组比较，健心颗粒组心脏指数、心肌梗死面积和LVEDP 值降低 （P＜0.05），±dP/dtmax值升高（P＜0.05），其作用与［Pyr1］ -Apelin-13 相当，而F13A 能逆转健心颗粒的作用 （P＜0.05）。

表2 健心颗粒对心力衰竭大鼠心功能及血流动力学的影响（±s，1 mmHg＝0.133 kPa）

表2 健心颗粒对心力衰竭大鼠心功能及血流动力学的影响（±s，1 mmHg＝0.133 kPa）

注： 与假手术组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与健心颗粒组比较，＆P＜0.05。

组别动物数/只 心脏指数/（g·kg-1） 心肌梗死面积/%心率/（次·min-1）收缩压/mmHg舒张压/mmHg假手术组112.19±0.360.00±0.00403±31142.79±12.4795.03±18.73模型组73.67±0.46*43.51±3.16*429±58115.43±17.7071.44±20.59健心颗粒组92.58±0.20＃30.78±4.87＃416±65128.56±11.6281.23±9.16 Apelin 组92.93±0.17＃32.01±3.12＃415±33135.37±16.6575.46±6.70健心颗粒＋F13A 组83.16±0.27＆40.09±4.51＆426±52123.92±20.1589.81±20.24组别动物数/只收缩压/mmHg舒张压/mmHgLVEDP/mmHg＋dP/dtmax/（mmHg·s-1）-dP/dtmax/（mmHg·s-1）假手术组11142.79±12.4795.03±18.735.41±0.348 902±573-7 218±580模型组7115.43±17.7071.44±20.5918.28±1.39*5 894±603*-5 347±495*健心颗粒组9128.56±11.6281.23±9.168.39±0.60＃6 719±726＃-6 785±597＃Apelin 组9135.37±16.6575.46±6.7010.96±1.83＃7 171±550＃-6 584±805*健心颗粒＋F13A 组8123.92±20.1589.81±20.2415.27±1.62＆6 235±693＆-5 962±621＆

3.3 健心颗粒对心力衰竭大鼠颈-股脉搏波传导速度的影响 如表3 所示，与假手术组比较，模型组颈-股PWV 值升高（P＜0.05），表明在心力衰竭情况下，动脉树明显僵硬； 与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组颈-股PWV 值降低（P＜0.05）； 与健心颗粒组比较，健心颗粒＋F13A 组颈-股PWV 值升高（P＜0.05）。

表3 健心颗粒对心力衰竭大鼠颈-股脉搏波传导速度的影响（±s）

表3 健心颗粒对心力衰竭大鼠颈-股脉搏波传导速度的影响（±s）

注： 与假手术组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与健心颗粒组比较，＆P＜0.05。

组别动物数/只颈-股PWV/（m·s-1）假手术组115.27±0.36模型组76.75±0.71*健心颗粒组95.79±0.62＃Apelin 组96.03±0.47＃健心颗粒＋F13A 组86.58±0.54＆

3.4 健心颗粒对心力衰竭大鼠心室-动脉偶联的影响 如图1 所示，与假手术组比较，模型组VAC 值升高 （P＜0.05）； 与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组VAC 值降低（P＜0.05）； 与健心颗粒组比较，健心颗粒＋F13A 组VAC 值升高（P＜0.05）。

图1 健心颗粒对心力衰竭大鼠心室-动脉偶联的影响（±s，n＝7～11）

3.5 健心颗粒对心力衰竭大鼠胸主动脉舒缩功能的影响如图2 所示，假手术组大鼠胸主动脉对去甲肾上腺素的Emax值为（31.98±3.61）%、pD2值为-6.15±0.60； 与假手术组比较，模型组大鼠胸主动脉对去甲肾上腺素的Emax值升高（P＜0.05），为（75.69±4.10）%，pD2值降低（P＜0.05），为-6.74±0.48，去甲肾上腺素剂量反应曲线非平行性向右下移位； 与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组血管环收缩效应降低（P＜0.05）； 与健心颗粒组比较，健心颗粒＋F13A 组血管环收缩效应增强（P＜0.05）。

图2 各组大鼠胸主动脉对去甲肾上腺素的浓度依赖性收缩曲线（±s，n＝7～11）

如图3 所示，假手术组胸主动脉对硝普那的Emax值为（96.31±6.90）%，pD2值为-7.72±0.10； 与假手术组比较，模型组胸主动脉对硝普那的Emax值降低（P＜0.05），为（63.9±5.6）%，pD2值升高（P＜0.05），为-7.12±0.80；与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组胸主动脉对硝普那的Emax值升高 （P＜0.05），分别为 （89.29 ± 8.4）%、（72.05±6.07）%，pD2值降低（P＜0.05），分别为-7.59±0.62、-7.63±0.82； 与健心颗粒组比较，健心颗粒＋F13A组胸主动脉对硝普那的Emax值降低（P＜0.05），为（68.34±9.50）%，pD2值升高（P＜0.05），为-7.20±0.46。

图3 各组大鼠胸主动脉对硝普那的浓度依赖性舒张曲线（±s，n＝7～11）

如图4 所示，假手术组胸主动脉对乙酰胆碱的Emax值为（93.69±7.10）%，pD2值为-7.75±0.51； 与假手术组比较，模型组胸主动脉对乙酰胆碱的Emax值降低（P＜0.05），为（21.98±3.1）%，pD2值升高（P＜0.05），为-6.43±0.45； 与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组胸主动脉对乙酰胆碱的Emax值升高 （P＜0.05），分别为 （55.59±4.5）%、（65.97±5.21）%，pD2值降低（P＜0.05），分别为-7.12±0.60、-7.46±0.58； 与健心颗粒组比较，健心颗粒＋F13A 组胸主动脉对乙酰胆碱的Emax值降低（P＜0.05），但pD2值无明显变化（P＞0.05）。

图4 各组大鼠胸主动脉对乙酰胆碱的浓度依赖性舒张曲线（±s，n＝7～11）

3.6 健心颗粒对心力衰竭大鼠主动脉形态学的影响 各组胸动脉横截面积、管腔直径、壁腔比均无明显差异。如图5所示，与假手术组比较，模型组胶原沉积增多（P＜0.05）；与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组胸主动脉胶原沉积减少（P＜0.05）； 与健心颗粒组比较，健心颗粒＋F13A 组胶原沉积增多（P＜0.05）。

图5 健心颗粒对心力衰竭大鼠主动脉胶原沉积的影响（Masson，×200，±s，n＝7～11）

如图6 所示，各组间的弹力纤维层数无明显变化（P＞0.05），但模型组弹力纤维排列明显紊乱，甚至有断裂现象。与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组弹力纤维板排列紧密、有序，弹力板结构完整。

图6 健心颗粒对心力衰竭大鼠主动脉弹力纤维的影响（Verhoeff，×200，±s，n＝7～11）

3.7 健心颗粒对心力衰竭大鼠主动脉Apelin、APJ 蛋白表达的影响 如图7～8 所示，与假手术组比较，模型组大鼠主动脉Apelin、APJ 蛋白表达降低（P＜0.05）； 与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组大鼠主动脉Apelin、APJ 蛋白表达升高（P＜0.05）； 与健心颗粒组比较，健心颗粒＋F13A组大鼠主动脉Apelin、APJ 蛋白表达降低（P＜0.05）。

图7 各组大鼠胸主动脉Apelin 蛋白免疫组化染色（×200）

图8 健心颗粒对心力衰竭大鼠主动脉Apelin、APJ 蛋白表达的影响（±s，n＝7～11）

3.8 健心颗粒对心力衰竭大鼠血清Apelin、BNP、NO 水平的影响 如表4 所示，与假手术组比较，模型组大鼠血清BNP 水平升高 （P＜0.05），Apelin、NO 水平降低 （P＜0.05）； 与模型组比较，健心颗粒组和Apelin 组大鼠血清BNP 水平降低 （P＜0.05），Apelin、NO 水平升高 （P＜0.05）； 与健心颗粒组比较，健心颗粒＋F13A 组大鼠血清BNP、Apelin、NO 水平降低（P＜0.05）。

表4 健心颗粒对心力衰竭大鼠血清Apelin、BNP、NO 水平的影响（±s）

表4 健心颗粒对心力衰竭大鼠血清Apelin、BNP、NO 水平的影响（±s）

注： 与假手术组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与健心颗粒组比较，＆P＜0.05。

组别动物数/只Apelin/（ng·mL-1）BNP/（pg·mL-1）（NO2-/NO3-）/（μmol·L-1）假手术组116.69±0.8351.78±4.7225.68±3.05模型组72.17±0.35*593.35±65.68*12.58±4.20*健心颗粒组93.67±0.46＃362.57±40.27＃19.31±2.40＃Apelin 组94.25±0.51＃240.63±31.58＃17.58±1.69＃健心颗粒＋F13A 组83.03±0.26＆156.42±32.80＆14.05±2.47＆

4 讨论

全身动脉弹性及左心室功能的协调是冠状动脉血流和左心室功能的重要决定因素。正常情况下，左室与动脉系统互相匹配形成稳定、有效的VAC 关系，使心室泵血功能优化达到最大传递效能［13］。心力衰竭时心室-动脉偶联关系异常，机械性能下降。本研究发现健心颗粒能改善心力衰竭大鼠左室功能，降低动脉PWV，减少胸主动脉胶原含量，改善心力衰竭中的心室-动脉脱偶联，且上述效应随着Apelin 通路活化或抑制而发生相应变化。Ceiler 等［14］研究表明，冠状动脉结扎18 周后，胸主动脉顺应性降低，僵硬度增加。有研究表明，心肌梗死后心力衰竭大鼠出现胸主动脉胶原纤维增加，收缩血管反应性增强，舒张反应减弱［15-16］。本研究结果与报道一致，大鼠冠状动脉结扎13 周后，模型组大鼠LVEDP、心脏指数、PWV 值和胸主动脉胶原含量增加，弹力纤维排列紊乱。但也有研究认为大鼠心肌梗死后3 ～4 周主动脉弹性没有任何变化，这可能与心肌梗死后，血管结构变化发生较晚有关［17］。目前尚无治疗心力衰竭的中成药改善动脉弹性的文献报道。本研究发现，健心颗粒能降低心力衰竭大鼠PWV 值，改善胸主动脉胶原纤维、弹力纤维重构和动脉舒缩功能。

近年来，以优化心室-动脉偶联为导向的治疗方案已成为研究的新亮点，在临床治疗中获益颇丰［18］。Ea/Ees 比值是经典评估VAC 的方法［19］，通常在1.0±0.36 左右［20］。心力衰竭时，收缩性下降，僵硬度增加，导致Ees 下降，全身组织灌注不足，肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统过度激活，增加血容量和动脉负荷，代偿受损的全身灌注，使得Ea 增加，Ea/Ees 值增高，发生脱偶联，最终导致终末器官灌注不足［21］。通过扩血管药物和（或） 正性肌力药物可以改善收缩期心力衰竭患者的偶联和功能。研究表明扩血管药物能降低Ea，而正性肌力药物能增加Ees，两者都可改善Ea/Ees 值［22］。另有研究发现，大鼠前降支结扎8 周后，出现Ea/Ees 值增高； 而美托洛尔能降低Ea/Ees 值［23］。本研究结果显示，心力衰竭大鼠出现心室-动脉偶联指数增高，而健心颗粒能降低VAC，说明其可能通过抑制心室重构与神经内分泌系统激活，纠正心力衰竭中的脱偶联关系，最终改善终末器官灌注。

Apelin/APJ 受体系统是调控心血管生理功能的重要内分泌系统，其活性异常参与高血压、动脉粥样硬化及心力衰竭等心血管疾病的发生、发展。Apelin 通过促进内皮细胞释放NO，从而扩张血管、增加心肌收缩力［24］。本研究结果表明，健心颗粒可增加心力衰竭大鼠Apelin、APJ 蛋白表达和血清NO 水平，其作用与Apelin 相似； 用F13A 拮抗Apelin 后，健心颗粒上调Apelin、APJ、NO 的作用被抑制。

综上所述，健心颗粒可能通过Apelin-APJ-NO 通路改善心力衰竭大鼠心室-动脉脱偶联与动脉弹性，为健心颗粒治疗心力衰竭提供新的依据，但本实验结果有待系统临床研究进行进一步验证。