罕见抗-Dib 致严重胎儿新生儿溶血病的实验室检测与相关研究

廖志坚 贾双双 温机智 莫春妍 邵媛 张润青 罗广平 姬艳丽

(广州血液中心临床输血研究所广州市血液安全重点实验室，广东 广州 510095)

在国际输血协会(ISBT) 命名的血型系统中，Diego 为第10 号血型系统(DI，010)，包含22 个血型抗原(DI001～DI022)，其中最具有临床意义的2个对偶抗原分别是Dia和Dib[1]。 Diego 血型系统中抗-Dia，抗-Dib和抗-Wra是临床上最有意义的同种抗体，可引起轻重程度不等的胎儿新生儿溶血性疾病(hemolytic disease of the fetus and newborn， HDFN)和溶血性输血反应[1]，抗-Dia和抗-Dib通常是在前1 次血型不合妊娠或输血免疫后产生。 此前，由抗-Dib导致HDFN 的报道主要是来自日本人群[2-4]。 近年来随着我国输血相关检测技术的不断提高，陆续有抗-Dib导致HDFN 的病例报道，其临床意义不容忽视[5-7]。

1 材料与方法

1.1 标本来源

患儿，男，出生1 d 15 h，第2 胎，足月顺产，因新生儿高胆红素血症及新生儿贫血，黄疸及贫血持续加重由外地紧急转院至广州一三甲专科医院NICU 科治疗，因无法找到配合血液送检配血，在输血治疗前主要用静脉大剂量丙种球蛋白(IVGG)维持治疗。 患儿母亲，28 岁，G2P2，白族，于2015 年10 月第1 胎分娩第1 孩，无明显黄疸，分娩前输注了配血相合红细胞4 U。 患儿父亲为汉族。 用于筛选相合血液的标本来自产妇家属和健康无血缘关系献血者。

1.2 主要试剂与仪器

抗-A 及抗-B 血型定型试剂(批号:20200913，上海血液生物)； 单克隆抗-D 试剂(批号:BMG1604B，英国Milipore)；低离子抗人球蛋白卡(批号:50531.62.12，瑞士BIO-RAD)；新生儿血型卡(批号:20500.01，西班牙GRIFOLS)；意外抗体筛选细胞(批号:45330.78.X，瑞士BIO-RAD)；意外抗体鉴定细胞(批号:732105，匈牙利REAGENS)；菠萝酶(批号:BCCC9201，美国Sigma)；胰蛋白酶(批号:SLBS8956，美国Sigma)；抗胰蛋白酶(批号:SLBQ8063V，美国 Sigma)。 台式离心机(型号:KA2200，日本久保田)； DNA 提取仪(型号:Quick Gene-Mini80，日本Kurabo)； DNA 提取试剂盒(Quick Gene DNA whole blood kit S，批号:11904-07，日本Kurabo)；微量紫外线核酸蛋白分析仪(型号:P-330，德国Im-plen)，PCR 仪(型号:ABI，Veriti)卡式孵育器(型号:BS-F24，贝索)卡式离心机(型号:12SⅡ，瑞士BIO-RAD)；单克隆抗-Dib(澳大利亚红十字血液服务中心Yew wah Liew 惠赠)；抗-k(批号:NZD2101A，英国Milipore)；抗-Kpb(批号:32275-A2，法国DIAGAST)；Human IgG subclass kit 试剂盒(批号:8000150564，荷兰Sanquin)；Red Fluorescence Cell Linker 试剂盒(批号:MKCM8734，德国Sigma)；FITC 抗人CD14(批号:1075136，德国BD)；Ficoll 淋巴细胞分离液(批号:10300123，美国Cytiva)；RP-MI-1640(批号:8121313，美国Gibco)；胎牛血清( Fetal bovineserum ( FBS)， 批号:DF29570026，美国Hyclone)；磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline(PBS)，批号:AG29643103，美国Cytiva 公司)；流式细胞仪(型号:BD FACS Canto Ⅱ，德国BD)、KX-21N 分析仪(型号:XS-500i，德国Sysmex)、细胞培养箱(型号:Forma311，美国Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 血清学检测方法

1.3.1.1 新生儿溶血病检测

采用新生儿血型卡测定患儿血型及直接抗人球蛋白试验；采用Rh 血型分型卡检测Rh 其他抗原；对患儿压积红细胞进行酸放散处理，采用抗人球凝胶卡对患儿血浆及放散液进行意外抗体筛选试验。 相关操作按照试剂说明书进行。

1.3.1.2 患儿母亲血型抗原鉴定

采用试管盐水介质法检测ABO 和RhD 抗原；采用Rh 血型分型卡检测Rh 其他抗原；相关操作按照试剂说明书进行。

1.3.1.3 患儿及母亲意外抗体鉴定

1.3.1.3.1 酶溶液的配制

菠萝酶工作液(5 mg/mL)配制:将50 mg 菠萝酶粉末溶于10 mL(pH5.5)PBS 溶液；胰蛋白酶工作液(2.5 mg/mL)配制:将25 mg 胰蛋白酶粉末溶于10 mL(pH7.4 ～7.7)PBS 溶液；抗胰蛋白酶工作液(5 mg/mL)配制:将50 mg 抗胰蛋白酶粉末溶于10 mL(pH7.4～7.7)PBS 溶液。 充分溶解后分装于1.5 mL EP 管中，于-25℃保存备用。

1.3.1.3.2 酶处理意外抗体筛选及鉴定细胞的制备

将意外抗体筛选及鉴定细胞用生理盐水洗涤3 次后，制备成压积红细胞。 分别按1 ∶1(菠萝酶)或1 ∶4(胰蛋白酶和抗胰蛋白酶)的体积比加入压积红细胞及相应酶工作溶液。 混匀后，放入37℃水浴箱中，分别孵育10 min(菠萝酶)、30 min(胰蛋白酶)及60 min(抗胰蛋白酶)。 期间每隔10 min轻轻混匀1 次。 离心去除上清，用1×PBS 溶液洗涤4 次，去上清，再用生理盐水配制成1%～2%的红细胞悬液备用。

1.3.1.3.3 意外抗体鉴定

采用未经酶处理的意外抗体筛查细胞及抗体鉴定细胞通过试管盐水介质法和抗人球凝胶卡法，分别对患儿血浆进行意外抗体筛查，对患儿母亲血浆进行抗体鉴定。 再分别采用经3 种不同酶处理的意外抗体筛查细胞及抗体鉴定细胞，通过抗人球凝胶卡法分别对患儿血浆进行意外抗体筛查，对患儿母亲血浆进行抗体鉴定。 相关操作按照试剂说明书进行。

1.3.1.4 特殊血型抗原鉴定

用IgG 单克隆抗-Dib，抗-k，抗-Kpb，采用抗人球凝胶卡法，进行母亲红细胞特殊抗原鉴定，相关操作按照试剂说明书进行。

1.3.1.5 初步交叉配血

用患儿血浆与母亲红细胞，以及ABO 同型Di(b-)液氮解冻红细胞，采用抗人球凝胶卡法进行交叉配血。

1.3.2 抗体IgG 分型

根据Human IgG subclass kit 试剂盒说明书进行抗体IgG 分型检测。

1.3.3 流式细胞术检测单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验(the monocyte monolayer assay，MMA)

按照文献[8]中报道方法，混合3 ～5 人份献血者外周血，用Ficoll 分离单核细胞，同时用1 年后随访患儿母亲的血浆致敏PE 荧光标记的Di(b＋)红细胞，用单核细胞吞噬致敏红细胞后，裂解未吞噬红细胞，加入FITC 抗人CD14 单抗反应后，用流式细胞术检测单核细胞的吞噬效率，单核细胞吞噬效率计算方法为:PE 和FITC 抗人CD14 双阳性细胞群百分比除以FITC 抗人CD14 阳性细胞群的百分比。

1.3.4 分子生物学检测

1.3.4.1 基因组DNA 提取

吸取200 μL(EDTA-K2抗凝) 外周血标本，使用DNA 提取仪，按照DNA 提取试剂盒操作说明，提取基因组DNA，并使用微量紫外线核酸蛋白分析仪，测定DNA 浓度和纯度，所有操作均按试剂盒及仪器说明书进行。

1.3.4.2 基因测序

根据文献[9]中报道的方法，对患儿及母亲Diego 血型系统的编码DI基因第19 号外显子进行PCR 扩增，PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳(2%琼脂糖凝胶，150 V 电泳15 min) 检测后，送广州天一辉远生物科技有限公司进行Sanger 测序。 用DNAStar 软件对序列结果进行比对和分析。

1.3.5 配合性血液的大规模筛选

检测母亲抗体效价，以最大稀释倍数稀释母亲血浆，采用间接抗人球蛋白凝胶卡试验，对ABO 同型及O 型献血者红细胞进行配合性筛选。 具体步骤为:在96 孔板中，将献血者红细胞用加样仪稀释到1%浓度，在抗人球凝胶卡编上对应96 孔板的标记，用排枪加50 μL 红细胞悬液加入凝胶卡，再用排枪加25 μL 稀释好血浆到凝胶卡中，37℃孵育15 min后，离心看结果。 与母亲血型初筛反应阴性红细胞，再用单克隆抗-Dib进行Dib 抗原的确认。

2 结果

2.1 血清学结果

2.1.1 HDFN 试验

患儿血型鉴定结果为A 型，RhD 阳性，RhCE血型为CCDee；直抗IgG 强阳性(3＋s)；血浆及酸放散液与抗筛细胞反应均为阳性(表1)。

抗筛细胞Ⅰ抗筛细胞Ⅱ抗筛细胞Ⅲ游离试验2＋2＋2＋放散试验4＋4＋4＋

2.1.2 母亲血清学检测

母亲血型为A 型，RhD 阳性，RhCE 血型为CCDee，直接抗人球蛋白试验阴性。

2.1.3 意外抗体筛选与鉴定

患儿血清与抗筛细胞在盐水介质中反应均阴性，在抗人球介质凝胶卡中反应均阳性(2＋)，与菠萝酶处理后细胞反应增强(4＋)，与胰酶和抗胰蛋白酶处理后细胞反应强度稍增强(3＋)(表2)。

抗筛细胞 生理盐水NPTCⅠ02＋4＋3＋3＋02＋4＋3＋3＋Ⅲ02＋4＋3＋3＋Ⅱ

患儿母亲血浆与抗筛细胞及鉴定谱细胞在盐水介质中反应均阴性，在抗人球介质凝胶卡中反应均4＋。 与菠萝酶、胰酶和抗胰蛋白酶处理后细胞反应强度不变(均4＋)(表3)。 根据抗体对3 种酶处理红细胞的反应强度的变化分析，初步符合抗-Dib，抗-k 和抗-Kpb特性，即对菠萝酶、胰蛋白酶和抗胰蛋白酶处理细胞反应均抵抗。

序号Kell Rh MNS P Lewis Duffy Kidd Diego Lutheran 试验结果D CEce cw Kk Kpa Kpb M NSs P1 Lea Leb Fya Fyb Jka Jkb Dia Lua Lub N PTC 1＋＋00＋0＋00＋0＋0＋00＋＋＋＋＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋2＋0＋＋000＋＋＋＋＋＋＋＋0＋0＋＋000＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋30＋0＋＋00＋0＋＋0＋0＋0＋0＋＋000＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋400＋＋＋0＋＋0＋＋＋0＋0＋00＋＋＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋5000＋＋0＋＋0＋＋＋＋＋00＋0＋0＋0＋＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋6＋00＋＋00＋0＋0＋0＋＋0＋＋0＋000＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋7＋＋00＋＋0＋0＋＋0＋0＋000＋0＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋8000＋＋00＋0＋＋＋＋0＋0＋＋＋＋＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋9＋＋＋＋＋00＋0＋0＋＋＋＋00＋00＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋10 ＋＋00＋00＋0＋0＋＋＋00＋＋0＋＋＋0＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋11 00＋＋＋00＋0＋＋00＋＋＋0＋0＋＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋

2.1.4 患儿母亲特殊血型抗原鉴定

用针对3 种高频抗原的单克隆抗体，鉴定患儿母亲特殊抗原结果为Di(b-)，k(＋)和Kp(b＋)。

2.1.5 初步交叉配血

患儿血浆与母亲红细胞及A 型Di(b-)液氮解冻红细胞交叉配血主侧相合。 初步证实患儿母亲和患儿体内存在IgG 类抗-Dib，进一步检测母亲抗体的效价，结果为512。

2.2 抗体IgG 分型结果

对直抗IgG 强阳性的新生儿红细胞，采用Human IgG Subclass Kit 试剂盒对红细胞表面致敏的IgG 抗体进行IgG 亚型分型，结果显示为IgG1 和IgG2 亚型(稀释倍数分别达到2 430 和810)，IgG3及IgG4 亚型未检出(表4)。

亚型稀释倍数1030902708102430 7290 21 870 IgG14＋4＋4＋3＋2＋1＋00 IgG24＋4＋3＋2＋1＋000 IgG300000000 IgG400000000

2.3 流式细胞术检测单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验结果

单核细胞对未致敏红细胞(阴性对照)、抗-D单克隆抗体致敏红细胞(阳性对照)和人源抗-Dib致敏红细胞(试验组)吞噬效率，分别为1.52%、91.30%和88.83%，试验组的吞噬效率远高于阴性对照组，二者之间的差异具有统计学意义(χ2＝152.616，P＜0.001)(图1，表5)。

图1 使用流式细胞术检测抗体介导的单核细胞对致敏红细胞的吞噬活性Figure 1 Phagocytosis activity of monocytes on sensitized red blood cells by flow cytometry analysis

编号名称抗体种类 抗体效价直抗(Coom′s 卡)吞噬效率(%)Q2/(Q2＋Q3)1 阴性对照 RPMI1 640培养基/-1.52 2 阳性对照抗-D 致敏1 0243＋s91.30 3 母亲血浆致敏红细胞抗-Dib致敏1283＋s88.83

2.4 基因测序结果

Diego 系统血型抗原由DI基因编码的单核苷酸多态性引起的氨基酸决定，DI基因的c.2561T 位点编码的亮氨酸(Leu)表达Dia抗原，而c.2561C 位点编码的脯氨酸(Pro)则表达Dib抗原。[1]通过对DI编码基因外显子19 的c.2 561T/C 位点进行测序分析，结果表明患儿母亲该位点为c.2 561T/T 纯合子，推测的Diego 血型表型为Di(a＋b-)；患儿父亲该位点为c.2 561C/C 纯合子，推测表型为Di(ab＋)；患儿舅舅该位点为c.2 561T/C 杂合子，推测表型为Di(a＋b＋)(图2)。 患儿由于血量不足，未进行基因型检测。

图2 DI 基因外显子19 测序结果Figure 2 Sequencing results of exon 19 of the DI gene

2.5 配合型血液的大规模筛选及临床输血治疗

在患儿鉴定出抗-Dib随后的1 周时间内，利用稀释的患儿母亲血浆，从5 520 名献血者中筛查到2 名Di(b-)献血者的血液。 患儿出生后血红蛋白(Hb)从86 g/L 持续下降，在出生12 d 时最低下降到42 g/L；血胆红素升高以间接胆红素升高为主，出生d1 间接胆红素达到240.5 μmol/L，后经治疗持续下降至稳定水平。 在患儿贫血期间有核红细胞绝对值也处在较高水平，提示骨髓造血活跃。 在新生儿出生d 12，输注了1U Di(b-)的O 型洗涤红细胞，Hb 水平由输血前42 g/L 升至93 g/L(图3)。患儿后顺利出院，未再进行输血治疗；随访至1 岁时，生长发育正常。

图3 患儿出生后Hb、胆红素及有核红细胞变化Figure 3 The changes of hemoglobin， bilirubin and number of nucleated red cells of the newborn

后续在献血者中继续筛查Di(b-)稀有血型，筛选的献血者总数达到51 334 例，共筛查到17 名Di(b-)献血者，该数据表明Di(b-)在广州地区献血者中的分布频率约为三千分之一(0.033%，17/51 334)。

3 讨论

本研究通过血清学检测和DI基因测序[10]，成功鉴定了1 例Di(b-)稀有血型产妇产生抗-Dib所致的严重胎儿新生儿病例，通过及时的Di(b-)稀有血型血液的筛查，最终对该患儿进行了成功救治。 在本研究的病例中，患儿与母亲血浆及患儿红细胞放散液与全部抗筛细胞及谱细胞反应均为阳性，与母亲红细胞反应阴性，血清学格局提示该病例为母亲体内针对高频抗原意外抗体所致的HDFN。 进一步根据抗体对3 种酶处理红细胞的反应格局分析，认为初步符合抗-Dib，抗-k 和抗-Kpb特性(即对菠萝酶、胰蛋白酶和抗胰蛋白酶处理红细胞反应强度均抵抗)[3]，从而初步判断患儿体内抗体可能是针对这3 种高频抗原的其中1 种。 对母亲红细胞高频抗原的进一步鉴定，发现母亲为稀有的Di(b-)血型。 患儿血浆与母亲红细胞及液氮保存Di(b-)解冻红细胞反应阴性，进一步证实为针对高频Dib抗原的抗-Dib。 因母亲在第1 胎分娩时有过输血史，考虑是输血和第1 胎妊娠的免疫导致母亲体内产生了抗-Dib。 母体内的高效价(512)抗-Dib致敏了胎儿红细胞导致新生儿重度贫血及黄疸。 我们对患儿父亲及舅舅的DI基因第19 外显子测序分析，从基因层面及家系调查证实患儿母亲DI∗A/A基因型，舅舅是DI∗A/B杂合基因型，父亲是DI∗B/B纯合子，从分子生物学层面为患儿Diego 血型不合的HDFN 提供了证据[11]。

一般认为，抗-Dib属于IgG(IgG1 或IgG3)性质，只能通过间接抗人球蛋白方法检出[1]。 本研究也对抗-Dib亚型分型进行了检测，发现本例患儿红细胞表面包被的IgG 抗体亚型为IgG1 及IgG2 型，未检出IgG3 型[1]，一般认为当存在母婴Dib血型不合时，无论IgG1 或者IgG3 型的抗-Dib都有导致严重新生儿溶血可能性[4]，这次检出合并IgG2 亚型是否能导致严重新生儿溶血需要未来进一步研究确认。

在无法确定传统血清学方法检测到抗体的临床意义时，可以通过MMA 等体外功能性试验来加以补充。 通过体外观察单核细胞对致敏红细胞的吞噬或破坏作用，来推测红细胞抗体在体内是否具有临床意义。 MMA 检测除了可以应用于母婴血型不合导致的HDFN 发生严重与否的风险预测外[12]，还可以在血清学交叉配血不合的情况下，尤其是具有多种混合抗体难以获得完全相合的红细胞时选择体外吞噬率低于阈值的不相容红细胞进行输注，以保障血液供应和输血安全[13]。 在本试验中，我们采用改良的流式细胞术检测单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验，观察到患儿母亲抗-Dib体外单核细胞吞噬效率达到88.83%，接近于阳性对照(91.30%)，试验结果与临床表现的严重程度高度吻合，并且其高吞噬率提示只能找配血相合血液进行输注才能够达到输血治疗的目的。 此外，此试验方法改良了传统MMA 方法中耗时长，结果判读主观性较强等问题[14]，可作为预测抗体是否会导致胎儿溶血风险的有效方法，并且比常规抗体效价检测准确率更高，可以进一步改良后作为临床常规检测进行推广[4]。

Di(b-)表型在我国人群中分布罕见，临床也常常有Di(b-)血液的需求，因此是具有重要临床意义的稀有血型库建设种类之一。 以往报道显示日本人群中Di(b-)表型分布频率约0.2%；而我国人群中，上海地区645 名献血者中筛选出1 名Di(b-)表型；深圳市从2 990 名献血者中筛选到2 例Di(b-)；山东报道从345 名献血者中筛选出1 名Di(b-)表型，后来筛选2 643 名献血者，仅发现1例Di(b-)表型，推测中国人群中Di (b-)表型频率在1 /1 000 ～1 /2 000 之间[6]。 我们陆续从51 334名献血者中筛选到17 例Di(b-)，因此在广州地区人群中Di(b-)表型频率约为1/3 000 左右。

高剂量IVIG 可以治疗严重高胆红素血症，缓解贫血症状[8]，本例患儿经高剂量IVIG 治疗后黄疸症状得到一定缓解，但Hb 水平一直维持在40 g/L左右，无法通过自身造血恢复，最终还是通过输注筛选出的Di(b-)红细胞才得以康复，所以治疗抗-Dib导致的严重HDFN 常常存在严重贫血无法改善的情况，快速筛查到Di(b-)血液，进行输血治疗还是非常关键的。 本病例的救治提示我们稀有血型库建立工作的重要性和紧迫性，稀有血型库的建立不但可以在发现抗-Dib患者时及时找到相匹配的血液，而且日常稀有血型筛查过程中获得的Di(b-)鉴定红细胞，也能作为鉴定红细胞试剂，在鉴定抗-Dib或作为抗-Dib合并其他复杂抗体时的鉴定过程中发挥重要作用，因此平时积累并冻存适量的Di(b-)稀有红细胞对于提高参比实验室的鉴定能力也是非常重要的。 此外，由于用于筛查Di(b-)稀有血型献血者的抗-Dib单克隆抗体，国际上仍缺乏相应的商品化试剂的供应，在这种情况下，利用已经致敏个体体内的人源抗体开展大样本筛查是有效的补充途径。 本研究中，我们采用间接抗人球试验方法，利用母亲高效价人源抗体，进行适度稀释，后续进行大规模献血者的筛查，筛到了17 名Di(b-)稀有献血者，并进行甘油冰冻红细胞的制备，使稀有血型库的库存得到扩充。 当然，人源抗体的利用存在来源有限的局限性，进一步开发制备单克隆抗-Dib仍是血型血清学稀有血型筛查方法完善和创新的重要努力方向[15]。