ABO 亚型分子遗传学分析及罕见等位基因鉴定

宿军 王夕钢 杨红霞 车玲玲 任甜甜 杨春晴 赵玲 王胜

(1.潍坊市中心血站潍坊市血液研究所，山东 潍坊 261043； 2.潍坊市人民医院输血科)

在人类血型系统中，ABO 血型系统的抗原性最强，ABO 血型鉴定的准确性直接关系到患者生命安全[1]。 除正常ABO 血型外还存在着ABO 亚型(存在基因变异)和受病理、生理等因素影响的疑难血型，部分病例依靠血清学无法准确区分。 基因检测方法能够克服以上血型血清学检测局限，结果判断更加客观，逐渐成为准确判断疑难血型必不可少的重要辅助手段。 我们分析了本站及辖区医院95 例疑难血型血清学ABO 亚型标本的血清学格局和基因检测结果，报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2015 年3 月至2022 年5 月，本站检验科及辖区医院输血科因ABO 正反定型不符送检本室经血型血清学鉴定为ABO 亚型的标本95 例(献血者标本79 例，临床患者标本16 例)。 标本经离心分离红细胞、血浆(血清)后，取白膜层-80℃超低温冷冻保存集中进行血型基因检测，红细胞、血浆(血清)进行血型血清学ABO 血型鉴定。

1.2 试剂与仪器

抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、ABO 红细胞、A2 细胞均来自上海血液生物医药有限责任公司且在有效期内使用；核酸提取试剂(西安天隆科技有限公司，批号:22052810T147)；人类红细胞ABOcisAB B(A)基因分型试剂盒(PCR-SSP 法)、人类红细胞ABO-A 亚基因分型试剂盒(PCR-SSP 法)、人类红细胞ABO-B 亚基因分型试剂盒(PCR-SSP法) (批号分别为: K220706001、 K220526001、K220615001)均来自天津市秀鹏生物技术开发有限公司且均在有效期内使用。 洗涤离心机(KA-2200，日本久保田)、恒温水浴箱(HH.W21.600，上海医用恒温设备厂)、核酸提取仪(NP968-C，西安天隆科技有限公司)，基因扩增仪(LifeECO，杭州博日科技有限公司)，通用型电泳仪(JY300C，北京君意东方电泳设备有限公司)，测序仪(ABI 3130xl，美国ABI 公司)。

1.3 方法

1.3.1 ABO 血型血清学鉴定

待检红细胞用生理盐水洗涤后常规使用抗-A、抗-B 定型试剂，ABO 试剂红细胞进行盐水介质法ABO 正反定型，正反定型达不到两管强凝集(正定型4＋凝集，反定型2＋以上凝集)，采用改变反应温度、加做抗-AB、抗-A1、抗-H、A2 细胞，吸收放散试验等血型血清学方法鉴定是否有对应的弱抗原。以上试验均按照文献[2]要求进行操作。

1.3.2 DNA 提取

按照试剂盒说明书提取血液标本DNA，调整DNA 浓度至30～50 ng/μL、A260/A280值至1.6～2.0。

1.3.3 PCR-SSP 法检测ABO基因

严格按照人类红细胞ABO-cisABB(A)基因分型试剂盒(PCR-SSP 法)、人类红细胞ABO-A 亚基因分型试剂盒(PCR-SSP 法)、人类红细胞ABO-B亚基因分型试剂盒(PCR-SSP 法)说明书操作进行A 亚型、B 亚型、cisAB 和B(A)基因分型检测。PCR 反应程序:96℃预变性2 min；96℃变性20 s，68℃60 s，5 个循环；96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃45 s，10 个循环；96℃20 s，62℃50 s，72℃45 s，15个循环；72℃延伸2 min，4℃保存，扩增产物琼脂糖凝胶电泳。

1.3.4ABO基因第1～7 外显子测序

采用Sanger 测序的方法，对PCR-SSP 无法检测到亚型等位基因的标本分别进行ABO基因第1～7 外显子双链测序，并根据双链测序结果进一步单链测序，以确定突变位点以及明确突变点所在基因位置。 根据ABO基因序列信息ABO∗A1.01(A101；GenBank 登录号NG_006669.1)设计ABO基因第1～7 外显子的双链及单链测序扩增引物，测序引物与扩增引物一致。 按照以下反应体系进行扩增:dNTP-Buffer 工作液43.5 μL；Taq 酶(5 units/μL)0.5 μL；特异性引物对1 μL；DNA 5 μL；反应程序如下:96℃ 2 min，1 个循环；96℃/20 s，68℃/60 s，5 个循环；96℃/20 s， 64℃/50 s，72℃/90 s，10 个循环；96℃/20 s，61℃/50 s，72℃/90 s，25 个循环；72℃/5 min，1 个循环；4℃保存。 将目的片段进行扩增后，测序仪进行测序并读取结果。测序结果由Chromas 软件进行序列分析，测序服务委托天津市秀鹏生物技术开发有限公司。

2 结果

2.1 PCR-SSP 检测ABO 基因

95 例标本通过PCR-SSP 确认亚型等位基因76 例(21 个ISBT 和dbRBC 已命名亚型等位基因)，剩余19 例标本未发现亚型等位基因(表1)。

表1 21 个已命名的亚型ABO 等位基因Table 1 ABO named alleles:21 cases

2.2 ABO 基因第1～7 外显子测序

19 例经PCR-SSP 基因分型未发现亚型等位基因的标本通过双链测序确认未命名新等位基因标本8 例，为了进一步确定突变所在等位基因，进行4例标本的基因单链测序(表2 和图1)。 S011 标本ABO基因在ABO∗A1.02/ABO∗B.01 的基础上，其第7 外显子上的第978 号碱基发生了C＞A 的杂合突变，进一步进行B 等位基因单链测序，证明该突变点位于ABO∗B.01 基因上。 S028 标本ABO基因在ABO∗A1.02/ABO∗B.01 的基础上，其第6 外显子上的第248 号碱基发生了A＞T 的杂合突变，进一步进行A和B等位基因单链测序，证明该突变点位于ABO∗A1.02 基因上。 S057 标本ABO基因在ABO∗B.01/ABO∗O.01.02 的基础上，其第3 外显子上的第125 号碱基T 发生了1 次重复，进一步进行B等位基因单链测序，证明该突变点位于ABO∗B.01 基因上。 S121 标本ABO基因在ABO∗B.01/ABO∗O.01.02 的基础上，其第2 内含子的第1 号碱基发生了G＞A 的杂合突变(粉红色部分内含子序列)，进一步进行B等位基因单链测序，证明该突变点位于ABO∗B.01 基因上。 S012 标本ABO基因在ABO∗A1.02/ABO∗O.01.02 的基础上，其第1 外显子上的第28 号碱基发生了G＞T 的杂合突变(粉红色部分内含子序列)，标本因标本不足无法进行单链测序验证，没有确认突变点具体的等位基因位置。 S021 标本ABO基因在ABO∗A1.01/ABO∗B.01的基础上，其第7 外显子上的第538 号碱基发生了C＞T 的杂合突变，因标本量不足无法进行单链测序验证，没有确认突变点具体的等位基因位置。 S026该标本ABO基因在ABO∗A1.02/ABO∗B.01 的基础上，其第1 外显子上的1 号碱基发生了A＞G 杂合突变，因标本量不足无法进行单链测序验证，没有确认突变点具体的等位基因位置。 S100 标本ABO基因在ABO∗A1.02/ABO∗O.01.01 的基础上，其第7 外显子上的797 号碱基位置插入1 个T，因标本量不足无法进行单链测序验证，没有确认突变点具体的等位基因位置。 剩余11 例标本经测序，未发现在1～7 外显子测序检测范围内的亚型等位基因(表3)，推测在检测范围外存在基因变异或者标本病理、生理等原因造成的非基因变异的ABO 疑难标本。

图1 ABO 基因测序结果Figure 1 Sequencing results of ABO gene

表2 8 个未命名的罕见ABO 等位基因Table 2 unnamed rare ABO alleles:8 cases

表3 11 例基因1～7 外显子测序检测范围无基因变异的标本血清学格局Table3 Serological pattern of 11 samples without gene variation in the detection range of exon 1-7 of ABO gene

2.3 血清学格局与基因检测结果对应分析见表4。

表4 Bw03/0 基因型标本的血清学格局Table 4 Serological pattern of Bw03/0 genotype

3 讨论

在本研究中，我们调查了95 个血清学ABO 亚型个体，鉴定到29 个罕见的ABO 等位基因，其中包括21 个已命名等位基因和8 个未命名等位基因。 21 个已命名的等位基因中频率最高的亚型依次为ABO∗BW.03、ABO∗BA.04、ABO∗AEL.05、ABO∗BA.02、ABO∗cisAB.01(表1)，等位基因频率与国内上海地区报道[3]基本一致，但同时存在一定地域差异，ABO∗AEL.05 等位基因在本研究中检测到7 例，明显高于大多数亚型等位基因，这一现象的发现对于了解中国北方地区ABO 等位基因频率的特异性具有重要的参考价值。 8 个未命名新等位基因中有5 例在外显子6 和7 处发生突变，外显子1 和3 处分别有1 例，1 例突变在2 内含子区(表3)。 检索国内报道，我们发现8 个未命名新等位基

因中的538C＞T[4]、248A＞T[5]、797insT[6]曾有相关的个例报道，徐秀云等[4]在2017 年首次在中国汉族儿童中发现1 例新的538C＞T 变异B 型等位基因，该B 变异基因具有家族遗传性，而且当它与O基因等位共存时，血清学表现型为正常B 型，当它与A基因等位共存时，血清学表现出ABx 亚型。赵领军等[5]于2017 年报道ABO 第6 外显子存在248A＞G 突变，导致糖基转移酶83 位天冬氨酸被甘氨酸替代(Asp83Gly)，阐述ABO基因248A＞G 变异体和A 抗原极低水平表达相关。 该报道虽然跟本研究在同一位置的突变方式不同，但最终导致血清学亚型表征基本相同，说明本位置碱基改变对基因表达具有影响。 胡俊华等[6]在2019 研究首次发现797 位置发生797insT 突变，该标本血清学格局与本研究基本一致。 对8 个未命名新等位基因，我们检索国内相关文献有5 例未见报道，这些等位基因的发现填补了国内ABO新等位基因的空白，在本研究后期需要补充相关等位基因单克隆测序或进行家系研究，以确定5 种新等位基因的稳定遗传性。

通过本研究，我们探讨了血清学ABO 亚型的分子遗传背景，综合所有突变，我们发现大部分的基因变异集中在外显子6 和7 上，一部分在1～5 外显子，同时极个别内含子及调控区域也决定了ABO血清学的表型。 同时结合血清学格局，我们发现在相同的基因遗传背景下，血清学格局往往呈现不一致的表现，如本研究发现基因频率最高的Bw03/O基因(表4)，8 例标本中正定抗-B 反应呈现2 ～4＋的不同凝集强度，反定抗体w＋/0 表现不一，我们推测患者的病理、生理及血清学试剂对结果产生一定的干扰作用，所以联用血清学和分子生物学检测技术，通过分子生物学确认亚型，对血型亚型的准确鉴定具有重要作用。

但在本研究中，我们发现了11 例基因检测范围内无基因变异的标本，S027、S058 标本血清学吸收放散试验均未检出弱抗原，可以判断为血浆中抗体弱导致的ABO 正反定型不符。 其余9 例标本表现为血清学表型与基因检测结果不一致的情况(表3)，我们分析，鉴于目前本研究的测序范围为ABO基因1～7 外显子，推测可能在此范围外存在一定的基因变异导致上述血清学亚型的表现，如报道ABO 内含子1 的＋5.8-kb 的转录调控区域变异造成的亚型表现[7]，本研究后期收集标本后会进一步对ABO基因调控区域进行基因序列的分析，以明确这9 例标本的表型是否由调控区域突变造成。 同时我们发现此9 例标本中的3 例患者标本:S076 标本患者临床诊断为白塞病，S085 标本患者临床诊断为骨髓增生异常增合症，S105 标本患者临床诊断为阵发性睡眠性血红蛋白尿，此3 名患者标本血清学检测均怀疑为ABO 亚型，但基因检测均不存在亚型基因变异。 此种现象符合国内外的相关报道，对于血液病等患者，在ABO基因不发生变异的情况下，疾病本身会对患者的ABO 抗原表达造成减弱，对临床常规的血清学血型检测造成干扰[8]。 鉴于此9 例结果，我们建议对于血清学亚型标本扩大基因检测范围，使用分子生物学检测技术对亚型准确鉴定，可以筛选出因病理等原因造成的非基因变异的ABO 疑难标本，为临床推荐精准的输血策略[9-15]。