核转录因子红系2相关因子2和p62在宫颈鳞状细胞癌和上皮内病变中的表达及诊断价值

郑桂华，金晓霞，陶玉梅，刘丹阳，朱兴华，卫颖泽

作者单位：1南通市肿瘤医院/南通大学附属肿瘤医院病理科，江苏 南通 226361；2南通市妇幼保健院病理科，江苏 南通 226007；3复旦大学附属妇产科医院病理科，上海 200090

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率均位于女性恶性肿瘤第四位，2020 年全球新发病例和死亡病例大约分别为604 127例和341 831例［1］。在我国，宫颈癌的发病率和病死率均位于女性恶性肿瘤的前十位，分别是第六位和第七位［2］。组织病理学上宫颈癌主要分为两大类：起源于鳞状细胞的鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和起源于腺细胞的腺癌。SCC 约占宫颈癌的80%，一般由良性细胞不典型增生到宫颈上皮内瘤变（cervical inepithial neoplasm，CIN）发展而来［3］。

核转录因子红系2 相关因子2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一系列细胞保护基因的主要调节因子，能够在应激条件比如活性氧和亲电试剂等情况下保护细胞［4］。近年来，越来越多的研究表明Nrf2 在多种癌中过表达，并且发挥着重要的促癌作用［5］。已有研究发现Nrf2不仅在宫颈癌中发挥着重要的作用［6-7］，而且与正常宫颈鳞状上皮相比，Nrf2 和其下游基因醌NADH 脱氢酶1（NQO1）在宫颈SCC 表达最高，CIN 次之［8］，这一结果表明Nrf2 在正常鳞状上皮至SCC 发生过程中的作用。选择性自噬接头蛋白p62/Sequestosome1（SQSTM1）含有多种结构域，能够与包括有丝分裂原活化蛋白激酶激酶（MEKK）3，人BRCA1基因1相邻蛋白（Nbr1），受体相互作用蛋白（RIP）1，人哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）调节相关蛋白（Raptor），肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）6，自噬标志物LC3，Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1），泛素等分子结合，从而影响炎症、Nrf2、mTORC1、核因子-κB（NF-κB）等不同的信号通路。近年来，同样有越来越多的研究表明p62在多种恶性肿瘤中过表达，并且发挥促癌的作用［9］。然而，Nrf2 与p62 在宫颈癌和上皮内病变诊断中的价值尚未有研究报道，在宫颈不同病变中二者之间的相关性尚不明确。因此，在本研究中我们首先检测了Nrf2 和p62 在宫颈癌和上皮内病变中的表达情况并分析二者的相关性，最终评价其在宫颈癌和上皮内病变中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2008 年1 月至2021 年12 月南通市肿瘤医院病理科120 例宫颈SCC、102 例低级别鳞状上皮内病变（LSIL）和101 例高级别鳞状上皮内病变（HSIL）病人及49 例宫颈良性/反应性鳞状上皮病人的石蜡标本。本研究数据的使用已获得病人或其近亲属及健康体检者本人的知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试剂与方法

1.2.1 主要试剂小单克隆抗体Nrf2（1∶200，AB62352）购自abcam 公司，p62（1∶200，88588S）购自CST 公司，一抗稀释液和磷酸缓冲盐溶液（PBS）均购自北京中杉金桥公司，二抗和显影液购自Dako公司。

1.2.2 免疫组织化学法将4 μm 厚的石蜡切片置于65 ℃温箱中过夜，二甲苯常规脱蜡，依次经100%、95%、85%、75%乙醇去除多余液体，蒸馏水冲洗后，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修复液（pH 9.0）经高压修复，滴加一抗，室温下孵育1.5 h，滴加二抗，37 ℃温箱中孵育1 h，3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封固。为证明Nrf2和p62抗体免疫组织化学检测的特异性，我们设置了阴性对照和阳性对照。

1.2.3 结果判读由两名病理科副主任分别阅片并记录结果。Nrf2 和p62 以细胞质中呈淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。根据阳性细胞的染色强度计分［10］：无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。根据阳性细胞百分比计分：＜5%为1 分，5%～30%为2 分，＞30%～60%为3 分，＞60%为4 分。将两项得分结果相乘： 0 分为阴性（-），1～2 分为低表达（+），3～6 分为中等表达（++），＞6分为高表达（+++）。

1.3 统计学方法采用SPSS 21.0 软件进行统计。采用χ2检验比较各组间Nrf2 和p62 的表达，计数资料以例表示，采用Spearman 秩相关分析各组间Nrf2和p62 之间的相关性，采用二元logistic 回归分析和受试者操作特征曲线（ROC曲线）判断Nrf2和p62在各组间的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nrf2 和p62 在宫颈不同病变中的表达Nrf2和p62 在宫颈不同病变中均定位于细胞质。Nrf2 和p62 在良性/反应性宫颈鳞状上皮中的表达低于LSIL、HSIL 与SCC（Nrf2χ2分别为30.74、41.31、129.15；p62χ2分别为29.93、30.64、159.27。均P＜0.05），并且Nrf2 和p62 在LSIL 中的表达明显低于HSIL 与SCC（Nrf2χ2分别为126.71、176.49；p62χ2分别为101.14、60.02。均P＜0.05）。虽然p62 在HSIL 中表达低于SCC（χ2为126.93，P＜0.05），但是Nrf2在HSIL中表达高于SCC（χ2为161.64，P＜0.05）。见图1；表1。

表1 核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）和p62在宫颈不同病变中的表达情况比较/例

图1 良性/反应性鳞状上皮、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)、鳞状细胞癌(SCC)等宫颈不同病变中的HE形态（HE染色×200）及核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）与p62表达情况（免疫组织化学染色×200）

2.2 Nrf2 和p62 在宫颈不同病变中的相关性Nrf2 和p62 在良性/反应性宫颈鳞状上皮、LSIL、HSIL和SCC中均呈正相关性（均P＜0.05），见表2。

表2 核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）和p62在宫颈不同病变中的相关性/例

2.3 Nrf2 和p62 在宫颈不同病变中的诊断效能ROC曲线分析表明，除Nrf2在诊断HSIL与SCC中差异无统计学意义外，Nrf2、p62 以及联合Nrf2 和p62在诊断良性/反应性鳞状上皮与LSIL、良性/反应性鳞状上皮与HSIL、良性/反应性鳞状上皮与SCC、LSIL 与HSIL、LSIL 与SCC、HSIL 与SCC 各个组别中均差异有统计学意义（均P＜0.05）。与单独使用Nrf2或者p62 相比，二者联合鉴别这些宫颈病变效果更佳。见表3。

表3 核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）及p62在诊断宫颈不同病变中的ROC曲线结果

3 讨论

宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，而且近年来我国宫颈癌的发病年龄明显年轻化［11］。宫颈LSIL 和HSIL 进展为SCC 的概率分别为1%和20%～40%［12-13］，目前，除了人乳头瘤病毒（HPV）基因分型和p16INK4a基因以外，很少有其他分子标记在宫颈癌及癌前病变中被广泛应用。然而，p16INK4a阳性也不是作为判断HSIL的绝对指征，因此寻找更多的分子标记用于辅助诊断宫颈癌及癌前病变至关重要，从而避免育龄妇女可能增加流产或早产风险的不必要的外科治疗。

Nrf2最初被认为是预防癌症和其他疾病的化学预防化合物，随后诸多研究表明Nrf2 不仅是多种癌症发生、转移及抗药性的驱动因子，而且还具有调节代谢和其他基本细胞功能方面的新作用［14］。已有研究表明Nrf2在宫颈癌中的促癌作用。在维吾尔族女性中，宫颈SCC和CIN与Nrf2表达升高及Keap1表达降低有关。Nrf2 与组织学分级、淋巴结转移和肿瘤分期呈正相关，而Keap1和这些指标呈负相关。Nrf2促进宫颈SCC细胞的增殖、迁移和侵袭，并且抑制细胞凋亡。Nrf2有望成为宫颈癌病人预后差的指标［6］。Nrf2 和其下游分子NQO1 及血红素氧化酶-1（HO1）在宫颈肿瘤组织中不同程度地表达增高。在宫颈癌细胞CaSki 细胞中敲除Nrf2，其下游基因表达明显降低，并且促进了化疗药物诱导的细胞死亡。除此之外，体内实验证实顺铂联合Nrf2 敲除进一步抑制了肿瘤的生长［7］。在本研究中，我们同样发现与良性/反应性宫颈鳞状上皮相比，Nrf2 在宫颈SCC 中过表达。并且Nrf2 能够有效地鉴别良性/反应性宫颈鳞状上皮和LSIL 或LSIL 和HSIL。值得注意的是，Nrf2 在SCC 和HSIL 表达均高于良性/反应性宫颈和LSIL，但是在SCC 中Nrf2 的表达略低于HSIL，具体原因还有待在今后的研究中发现。

许多文献表明Nrf2和p62之间存在一个正反馈环。p62 堆积能够激活Nrf2 和其下游靶向基因，而Nrf2 也可以直接与p62 启动子区的抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）序列结合调节p62 的表达［15-16］。有学者发现敲减p62 后，宫颈癌细胞活力明显下降、凋亡增加，活性氧产生。而且在宫颈癌细胞中敲除p62 后，Nrf2 表达水平明显下降［17］，细胞水平证实二者具有相关性。目前Nrf2 和p62 在宫颈组织中的相关性尚不明确，本研究发现Nrf2 和p62 在良性/反应性宫颈鳞状上皮、LSIL、HSIL 和SCC 中均具有正相关性，我们在组织水平进一步证实了Nrf2 和p62 具有相关性。Nrf2 和p62 的相关性不仅在宫颈组织中得到证实，我们早期就在乳腺癌细胞和组织中发现Nrf2和p62能够相互调节并具有正相关性，诱导乳腺癌耐药［10］。在肝细胞肝癌和胰腺导管腺癌中也同样证实了Nrf2和p62之间具有相关性，从而诱导肿瘤的发生发展［18-19］。

p62 作为一种信号转导蛋白，不仅协调癌细胞的代谢重编，而且还调节肿瘤内正常细胞的功能，以支持肿瘤生长和增殖。越来越多的证据表明，p62 在各种癌症中都有异常表达，如肺癌、肝癌、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌等［20-21］。梁冠男等［22］研究发现p62在宫颈浸润性癌、CINⅡ/Ⅲ、CINⅠ、正常宫颈表达均不相同，且随病情的加重表达量会随之增加，我们的结果与其一致。本研究同样发现p62在良性/反应性宫颈鳞状上皮中表达最低，其次是LSIL、HSIL，在SCC 中表达最高。而且通过ROC 曲线分析显示p62 能够有效地鉴别良性/反应性宫颈鳞状上皮、LSIL、HSIL 及SCC。与单独使用Nrf2 或者p62 时相比，二者联合使用鉴别这些不同的宫颈病变效果更佳。

综上所述，Nrf2 和p62 在不同宫颈病变中表达各不相同，良性/反应性鳞状上皮中不表达或低表达，在LSIL 中表达有所增高，HSIL 和SCC 中表达最高，且二者在不同宫颈病变中均具有正相关性，单独使用或者二者联用均能够有效诊断不同的宫颈病变。Nrf2 和p62 有望成为像p16INK4a 一样作为临床诊断宫颈病变的分子标记。

（本文图1见插图3-5）