基于六偏磷酸钠-Fe2+的铁盐脱氮反应器运行性能及微生物学特征研究

赵治国， 杨富刚， 王雯谚， 刘梦瑜， 李湧， 谭焕*

（1.陕西冶金设计研究院有限公司， 西安 710018； 2.中国重型机械研究院股份公司， 西安 710018；3.中国市政工程华北设计研究总院有限公司 西安分公司， 西安 710018；4.西安文理学院 生物与环境工程学院， 西安 710065）

我国生活污水、 工业废水和农业面源污染携带大量含氮物质排入水体， 造成水体污染严重［1－2］。此类废水中有机物含量低， 氮素含量高， 依靠传统异养反硝化技术难以去除此类污染物。 水体氮素的完全去除还需额外投加有机物， 而投加有机物极易造成二次污染［3－4］。 因此， 基于Fe2＋的自养反硝化技术应运而生［5－6］。 1996 年， Straub 等［7－8］在城市下水道管网中分离获得了3 株可利用亚铁盐作为电子供体的反硝化菌株， 从此拉开铁盐脱氮研究序幕。目前Wang 等［9］已将该技术的脱氮效能提升到0.22 kg［N］／（m3·d）。 然而亚铁盐作为反硝化电子供体时， 二价铁氧化产物三价铁堆积在细胞表面形成铁壳， 进而影响微生物脱氮效能， 微生物的最佳脱氮效能仅维持14 ～20 d［10－11］。

目前针对解决“结壳”的方法多采用优化菌源、添加有机物、 使用螯合铁等方法［12］。 Zhang 等［13］发现低浓度有机物条件下EDTA－Fe 基质使细菌结壳方式改变。 Kumaraswamy 等［14］以乙醇和EDTA－Fe为电子供体研究了反应器的脱氮效能， 研究表明螯合铁更有助于反应器脱氮。 考虑到有机物可作为反硝化电子供体且EDTA 有生物毒性， 故而本研究选用六偏磷酸钠作为自养条件下Fe2＋的螯合剂。

研究采用实验室稳定运行的反应器中的反硝化污泥为接种污泥， 以六偏磷酸钠－Fe2＋为进水基质，在反应器层面、 颗粒污泥层面、 细胞个体层面及酶活性层面检测了基于铁盐的自养脱氮活性和微生物铁壳情况， 探究了基于六偏磷酸钠－Fe2＋的铁盐脱氮微生物特性， 阐述了铁盐脱氮工艺的优势， 为铁盐脱氮工艺的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂： NaHCO3， MgSO4·7H2O， CaCl2·2H2O， （NH4）2SO4， KH2PO4， NaNO3， FeSO4·7H2O，六偏磷酸钠， 以上试剂均为分析纯； 活／死细胞荧光鉴定试剂盒。

主要仪器： 分析天平（224S）， 紫外分光光度计（F－7000）， 荧光分光光度计（F－7000）， 透射电子显微镜（JEOL JEM－2100Plus）。

1.2 模拟废水

试验采用模拟废水， 具体成分如下： NaHCO32.50 g／L， MgSO4·7H2O 0.50 g／L， CaCl2·2H2O 0.01 g／L， （NH4）2SO40.28 g／L； KH2PO40.25 g／L， 六偏磷酸钠5.50 g／L； NaNO30.51 g／L； FeSO4·7H2O 4.1 g／L；氮源和能源以NaNO3和六偏磷酸钠－Fe2＋的形式按需添加， 并控制进水中Fe2＋与总氮的物质的量比为2.5 左右。 为保证Fe2＋不快速沉淀， 配水时先溶解六偏磷酸钠再加入FeSO4， 使得FeSO4与六偏磷酸钠充分螯合， 最后调节pH 值使之稳定。

1.3 接种污泥和反应装置

接种污泥为实验室高效反硝化反应器中的反硝化污泥［14］。 此反硝化污泥的MLSS 为27.82 g／L，MLVSS 为16.40 g／L。

反应装置采用上流式颗粒污泥床（UASB）（以下称铁盐脱氮反应器）， 反应器内径为65 mm（排气区内径为85 mm）， 反应区高380 mm（排气区高320 mm）， 总体积为3 L（为保证装置排气上方为放大圆柱体［9］）， 有效体积为1.2 L， 污泥接种量为800 mL。 反应器每日进水量为12 L， HRT 为6 h， 进水pH 值设定为6.4 ±0.1。 初始进水硝态氮质量浓度设定为84 mg／L， 进水Fe2＋质量浓度设定为826 mg／L； 硝态氮容积负荷为0.84 kg／（m3·d）； Fe2＋容积负荷为8.26 kg／（m3·d）。

1.4 试验方法

不同运行阶段的反应器的进水水质条件不同，具体情况如表1 所示。

表1 反应器进水水质条件Tab.1 Influent and effluent water quality of reactor

反应器正式运行（第0 天起）期间通过不间断的测定反应器每天进出水Fe2＋浓度及硝态氮浓度来考察反应器脱氮性能； 同时由于微生物是废水处理的关键所在， 因此在反应器运行过程中选取第1、15、 30、 57、 82 天的5 组污泥， 分别编号为T1、T2、 T3、 T4、 T5， 对各组污泥进行形貌观察、 活／死细胞检测、 碱性磷酸酯酶活性测定、 比活性测定。

（1） 污泥形貌观察。 利用相机对接种污泥和铁盐脱氮颗粒污泥进行观察并拍照， 记录污泥外部形貌， 如污泥密实度、 颗粒污泥粒径、 污泥色泽等。样品制备完成后在透射电镜下观察细菌形貌［15］。

（2） 活／死细胞检测。 取适量颗粒污泥溶于0.85% NaCl 溶液中， 利用细胞超声破碎仪破碎颗粒污泥以获得悬浮菌液， 将染色后的细胞置于荧光显微镜下观察活死状态， 利用Image－pro Plus 6.0软件对视野中活／死细胞个数进行统计并计算得出不同时间段活细胞占总细胞个数的比例［19］。

（3） 碱性磷酸酯酶活性测定。 取（0.05±0.01）g颗粒污泥， 悬浮于1 mL pH 值为8.0 的PBS 溶液中， 超声破碎1.5 min。 取超声产物， 测定对硝基邻苯酸二钠（pNPP）转化量并计算颗粒污泥的碱性磷酸酯酶（ALP）活性［20］。 pNPP 转化量越多则说明酶活性越强。

（4） 比活性测定。 采用批次试验测定颗粒污泥的比反硝化活性和比铁氧化活性， 取50 mL 模拟废水于65 mL 血清瓶中， 加入一定质量沥干颗粒污泥， 以氩气驱氧5 min， 按需投加六偏磷酸钠－Fe2＋，用丁基橡胶塞密封血清瓶并用铝盖加固。 血清瓶置于摇床上（180 r／min、 32 ℃）培养， 每组试验设置2个平行， 定时取上清液测定硝态氮、 Fe2＋含量［21］。比活性计算公式如下：

式中： RA为比活性， mg／（g［VSS］·L·h）； Ct为t 时刻指标质量浓度， mg／L； C0为0 时刻指标质量浓度， mg／L； m 为添加颗粒污泥质量， g； S为挥发性固体颗粒物占总颗粒污泥（湿基）的质量百分比， %； t 为培养时间， h。

1.5 分析方法

硝态氮浓度采用紫外分光光度法， Fe2＋浓度采用1，10－啉菲啰啉分光光度法， pH 值采用pHS－9V型酸度计测定， TS 和VSS 浓度采用重量法。

2 结果与讨论

2.1 铁盐脱氮反应器运行性能

铁盐脱氮反应器容积负荷和去除负荷随时间的变化情况如图1 所示。 根据反应器的操作条件及脱氮效能， 其运行过程分为以下4 个阶段：

图1 铁盐脱氮反应器性能Fig.1 Performance of ferrous ion－dependent nitrate removal reactor

阶段1（第0 ～20 天）： 该阶段硝态氮去除负荷逐渐下降， 这是由于六偏磷酸钠浓度过高， 导致反应器盐度上升， 高盐度通常会抑制酶的活性， 还会引起细胞质溶解［16－17］。

阶段2（第21 ～29 天）： 该阶段中， 最高硝态氮去除负荷为0.41 kg／（m3·d）， 最大铁去除负荷为2.15 kg／（m3·d）， 平均硝态氮去除率达57.6%； 该阶段反应器运行稳定但硝态氮去除率较低。 Straub等［18］的研究结果表明， 铁型反硝化的最适pH 值介于6.4 ～6.7。 传统异养反硝化最适pH 值介于7.0 ～8.0， 反应器调试阶段的进水pH 值维持在6.4 ±0.1， 出水pH 值维持在6.8±0.1， 分析其原因为接种污泥为传统异养反硝化污泥， 该接种污泥不能适应此时过低的进水pH 值， 从而导致此阶段反应器脱氮效能不佳。

阶段3（第30 ～64 天）： 自第30 天起改变反应器进水pH 值为6.8±0.1， 硝态氮及Fe2＋的容积负荷与阶段2 保持一致。 该阶段反应器运行稳定， 出水pH 值为7.2±0.1， 硝态氮去除负荷为0.41 kg／（m3·d）， 平均去除率高达97.6%， 高脱氮效能维持了28 d； 最大铁去除负荷为2.77 kg／（m3·d）， 平均去除率为52.5%， 铁去除负荷相对稳定。

阶段4（第65 ～88 天）： 第65 天后反应器脱氮效能经历波动， 硝态氮去除率最终稳定在45.7%。随着运行时间延长， 细菌表面不断生成铁壳， 引起细菌死亡， 但部分表面未结壳的细菌仍发挥着较好的脱氮效能。 因此， 经高效运行后反应器最终稳定在阶段4， 运行过程中未检测到亚硝酸盐积累。

2.2 铁盐脱氮微生物特征

2.2.1 结构特征

5 组污泥的形貌观察结果及生物活性测定结果如图2 所示。

图2 颗粒污泥形貌特征Fig.2 Morphology features of granule sludge

接种污泥为椭球形、 黄色、 表面光滑、 内部紧实。 随着反应器运行， 污泥表面从最开始的土黄色逐渐变为深灰褐色。 反应器进水不含有机物， 仅含有Fe2＋并作为电子供体， 碳酸氢盐作为碳源， 反应器内污泥生长缓慢， 细胞几乎不产生胞外多聚物，使得细胞相互之间的粘附性差。 反应器运行后期颗粒污泥解体， 反应器内部多为碎片状絮体污泥（后期反应器内很难找到颗粒污泥， T4、 T5样品为解体污泥堆积而成）。

为探究六偏磷酸钠螯合模式下的铁盐脱氮反应器高效能的原因， 进一步采用透射电镜观察了T1～T5中微生物细胞的内部结构， 结果如图3 所示。

图3 TEM 下颗粒污泥细胞形貌特征Fig.3 Morphology features of granule sludge under TEM

随着反应器运行时间的延续， 污泥中细胞外周附着的铁矿物（铁壳）逐渐增多， 与Schmid［22］的试验结果不同的是， 附着在细胞表面的“铁壳”存在方式较单一， 仅为包裹式， 且包裹层较薄。 有研究表明， 由微生物介导的硝酸盐型铁氧化是由生物反应和化学反应耦合完成的， 生物反应和化学反应均会生成不同形式的铁矿物［12，23］。 这些铁矿物是以包裹式或犄角式分布于细胞周围， 且与细菌种类和基质种类有关［24－25］。 在反应器中出现单层铁壳包裹是因为六偏磷酸钠－Fe2＋相对分子质量较大， 难以通过通道蛋白进入细胞， 故而Fe2＋只能在胞外失去电子。 针状铁会刺破细胞膜导致细菌死亡［22］， 试验过程中未见犄角式或针状铁壳， 即六偏磷酸钠不会引起针状铁壳的形成， 从而减缓了细菌的死亡。

从图3 中可以观察到3 种细胞形态： 活菌、 肿胀菌和死菌。 活菌的细胞膜完整， 细胞内含物清晰， 如图T2－1及T5－1中a 所示； 肿胀菌一般表示受损细菌， 细菌生长状态不良， 包膜紧张、 边缘外翻细胞膜界线不清， 如图T2－1及T5－1中b 所示； 死菌细胞膜受损， 通透性增加， 如图T2－1及T5－1中c所示。 为了确定铁在细胞内／外的堆积位点， 使用激光拉曼光谱仪（HR Evolution）对图3 中不同形态细胞内／外的铁含量进行了能谱分析， 结果如表2所示。

表2 激光拉曼光谱仪下活菌、 肿胀菌和死菌内／外铁质量分数Tab.2 Mass fractions of iron in inside and outside of viable organism, swellen bacteria and dead bacteria under laser raman spectrometer

由表2 可知， 活菌表面及中心的铁质量分数极少， 均为0.02%； 在肿胀菌的中心和边缘都检测到了铁的存在， 质量分数分别为0.14%、 0.26%； 死菌中心和边缘同样检测到了铁的存在， 其质量分数分别为0.30%、 0.29%。

不同形态细菌的表面和中心检测到的铁含量不同， 推测其原因是反应器运行前期Fe2＋无法进入细胞， Fe2＋在胞外失去电子， 变成Fe3＋； 随着时间的延续， Fe3＋在胞外沉积形成铁壳， 导致微生物细胞无法与外界进行正常物质交换， 微生物活性下降，细胞表面通透性改变， 部分Fe2＋进入细胞内部进行电子代谢； 当进入细胞的Fe2＋增多， 大量Fe3＋在胞内积累， 细菌逐步死亡裂解。

2.2.2 微生物比活性

采用分批试验测定了颗粒污泥的比活性， 结果如图4 所示。 接种颗粒污泥比反硝化活性为0.71 mg［N］／（g［VSS］·h）， 比铁氧化活性为7.3 mg［Fe］／（g［VSS］·h）。 随着反应器运行时间的延续， T1～T5的比反硝化活性和比铁氧化活性均呈先下降后上升趋势。 反应器运行后期污泥（T5）的比反硝化活性为2.3 mg［N］／（g［VSS］·h）， 同比上升224%； 比铁氧化活性为15 mg［Fe］／（g［VSS］·h）， 同比上升105%。前期比活性下降是因为盐度及pH 值不适， 后期经过调节随着反应器运行微生物比活性逐渐增加。 反应器运行第82 天T5组中仍存在未被铁包裹的活菌， 结合图4 可以看出从T3～T5脱氮效能逐渐增加， 说明六偏磷酸钠－Fe2＋反应器中活菌的生存状态良好。

图4 颗粒污泥相对比活性Fig.4 Relative specific activity of granular sludge

2.2.3 生物活性

采用比色法测定了T1～T5的ALP 活性， 结果如图5 所示。 随着反应器运行时间的延长， 样品中ALP 活性逐步上升。 T1的ALP 活性为0.45 μmol／（g［VSS］·min）， T5的ALP 活性为11.12 μmol／（g［VSS］·min）， 是T1的24 倍， 说明六偏磷酸钠－Fe2＋反应器中细菌虽有死亡但活菌活性增加。 随着部分细菌死亡， 系统VSS 容积负荷不断增高， 因此部分细菌的活性增加。

图5 颗粒污泥中ALP 活性Fig.5 Activities of ALP in granular sludge

采用Live／Dead Baclight 试剂盒， 对T1～T5的活细胞和死细胞进行了染色， 并于荧光显微镜下观察， 对视野中的活细胞及死细胞进行计数， 并计算活细胞占总细胞数的比例， 结果如图6 所示。 随着反应器运行时间的延长， T1～T5中的活细胞比例逐渐降低， 死细胞比例逐渐上升。 对图6 中的数据进行线性拟合， 所得斜率即为反应器中细胞的死亡速率。 由图6 可知， 以六偏磷酸钠－Fe2＋为进水基质的反应器中细胞死亡速率为0.42%， 该速率是文献［15］中以FeSO4作为进水基质的反应器中细胞死亡速率的一半。

图6 颗粒污泥中活细胞占总细胞数的比例Fig.6 Percentage of live cells in granular sludge

反应器正式运行时的污泥（T1）中的活细胞比例最高， 为89.6%； 此后颗粒污泥中的活细胞比例逐渐下降， 最终降至55.6%。 由于铁沉积物堆积在微生物表面阻碍微生物与外界进行物质交换， 使基质无法顺畅进入微生物细胞。 同时堆积在微生物内部的铁沉积物占用微生物内部空间， 影响了微生物的正常生理代谢， 使得微生物活性降低甚至失活。

3 结论

（1） 本试验条件下， 铁盐脱氮反应器的脱氮效能可维持在0.41 kg［N］／（m3·d）达28 d 之久， 表明使用六偏磷酸钠－Fe2＋基质延长了铁盐脱氮污泥反硝化高效期。

（2） 六偏磷酸钠－Fe2＋基质下的颗粒污泥中细胞存活率、 酶活性、 比铁氧化活性以及比反硝化活性有显著提高， 表明六偏磷酸钠－Fe2＋基质增强了活细菌的生物活性和反硝化活性。

（3） 对于一部分微生物， 六偏磷酸钠－Fe2＋基质改变了细胞结壳方式， 铁的存在形态主要表现为絮状包裹式， 铁的堆积路径主要表现为先堆积在微生物表面再进入微生物内部， 同时六偏磷酸钠－Fe2＋基质延缓了细菌结壳时间， 使其死亡速度变慢； 对于另一部分微生物， 六偏磷酸钠－Fe2＋基质不会造成铁在其表面堆积， 微生物仍保持较好的脱氮效能。