基于ERS 信号蛋白异常表达探讨清肝降浊方治疗NAFLD 的机制研究

丁云录，薄天儒，王铁成，李驰坤，李晓兵，欧喜燕，刘彦晶*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林国文医院，长春 130012；3.长春金赛药业有限责任公司，长春 130012）

随着高脂高热量食物在人们饮食结构中比重的日益增加，社会肥胖率呈现出大幅度增长趋势，非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）病发率也随之提高，据目前调查数据显示，我国NAFLD 新发人数比例以每年4%的速度增加，已成为威胁我国居民健康的第一大慢性肝病[1-3]。该病的发病机制尚不明确，并且现代医学尚无理想的治疗药物，中医学认为NAFLD 病位在肝，涉及脾肾，主要病机以肝脾肾功能失调为本，痰湿、瘀血交阻互结停积于肝而形成脂肪肝。而采用中医药治疗本病在减少脂肪沉积、改善肝功、调节脂质代谢及降低不良反应方面具有独到优势，研究前景广阔。

清肝降浊方是基于长春中医药大学附属医院的临床验方研制的一种预防治疗脂肪肝的新型中药制剂，疗效显著，但清肝降浊方干预NAFLD 的具体作用机制尚不明确。最新证据表明内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与NAFLD 的发病有极为密切的联系，PERK/eIF2a/ATF4 信号通路是ERS 中参与脂质代谢调节和细胞凋亡的关键信号转导通路，在NAFLD的形成过程中具有重要意义[4]。本次研究，清肝降浊方以PERK/eIF2a/ATF4 信号通路为基础，检测相关蛋白，从而明确其治疗NAFLD 的作用机制，对于寻求NAFLD 更有效的治疗方案及进一步发扬中医药的优势有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 动 物 SD 大鼠，SPF 级，雄性，体质量（220.1±13.6）g。自由摄食、饮水，分笼饲养，室温（22±2）℃，日温差：≤4 ℃，相对湿度：40%～70%，与相通房间的最小静压差：10 Pa，氨浓度≤14 mg/m3，噪音：≤60 dB，最低工作照度：150 Lm，昼夜暗交替时间：12 h/12 h。伦理许可证号：2021137。1.1.1 药品 清肝降浊方（ 深棕褐色颗粒，20211215），长春中医药大学附属医院实验中心。易善复，批号：CBJD333，国药准字：H20059010，赛诺菲（北京）制药有限公司产品。

1.1.2 试剂 碱性磷酸酶试剂盒（223741，10 mL×10支）、天冬氨酸氨基转移酶试剂盒（221591，10 mL×10 支）、丙氨酸氨基转移酶试剂盒（224961，10 mL×10 支）、总胆固醇检测试剂盒（225351，10 mL×10支）、三酰甘油检测试剂盒（224281，10 mL×10支），中生北控生物科技股份有限公司；总超氧化物歧化酶（T- SOD）测试盒，规格：50 管/48 样，批号：20221018，游离脂肪酸（NEFA）测试盒，规格：50 管/48 样，批号：20220915，丙二醛（MDA），规格：50管/48 样，批号：20220927，南京建成生物工程研究所。ATF4抗体，规格：100 µg/mL，批号：D0581，eIF2a抗体，200 µg/mL，批号：C2473，CHOP 抗体，100 µg/mL，批号：S3627，Santa Cruz。

1.1.3 仪器 全自动分析仪（selectra junior），荷兰威图；酶标仪（BIO680），BIO RAD 公司；蛋白凝胶成像仪（TACON320），GE 公司；倒置荧光显微镜（IX71），OLYMPUS；高速冷冻离心机（Biofuge Stratos），德国贺利氏公司。

1.2 方法[5-10]

1.2.1 动物分组 将60 只SPF 级SD 雄性大鼠适应性喂养1 周后，称重，按体质量大小编号，通过随机数字表法，将实验大鼠随机分为正常对照组；脂肪肝模型组；易善复胶囊组；清肝降浊方设高、中和低3 个给药剂量组。共6 组，每组10 只。

1.2.2 模型制备 正常对照组给予标准饲料饲养；其余各组均饲喂高脂饲料，高脂饲料配比（82.3%标准饲料+ 15%猪油+ 2%胆固醇+ 0.2%丙硫氧嘧啶+ 0.5%胆酸钠），连续8 周。

1.2.3 给药方法 从第9 周开始阳性对照组给予易善复悬浮液244.3 mg/kg 灌胃，清肝降浊方3 个剂量组给药剂量分别为865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg，给药方式为灌胃给药，给药体积均为10 mL/kg，模型组和正常对照组给予等体积10 mL/kg 蒸馏水灌胃，持续给药4 周。

1.2.4 标本留取 给药周期结束，大鼠禁食不禁水12 h，称重、麻醉。腹主动脉取血，室温静置30 min，3 000 rpm离心15 min，分离血清。剪取肝脏，置于-80℃超低温冰箱保存。肝组织匀浆样本处理：准确称取肝组织重量，按重量（g）:体积（mL）=1:9 的比例，加入9 倍体积的匀浆介质，冰水浴条件下机械匀浆，2 500 转/分，离心10 min，取上清液待测。

1.2.5 检测指标 1）日常状态观察：每日定时观察各组大鼠的进食及饮水情况、毛发色泽、活动情况、粪便性状等，每周对大鼠称重并记录。2）肝功能指标AST、ALT、AKP 检测、血清中TC、TG、NEFA 及肝组织匀浆中TC、TG 检测、肝组织匀浆中SOD、MDA检测，按试剂盒说明书操作检测。3）蛋白免疫印迹（Western-blot），制备样本：每个实验组各取50 mg肝脏组织，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸化抑制剂混合物，匀浆，离心（4 ℃，16 000 rpm，30 min）后取上清。制胶及电泳、转膜及封闭、一抗孵育、二抗孵育，将PDF 从二抗稀释液中取出继续用TBST 漂洗，加入ECL 发光液后于凝胶成像仪上显影拍照。检测信号通路相关蛋白的表达水平，大鼠ATF4、eIF2a、CHOP 表达量。

1.3 统计学方法 试验结果以均数±标准差（±s）表示，统计学处理方法采用组间t检验。

2 结果

2.1 对肝功能相关指标的影响 清肝降浊方865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 给药组动物血清AST、AKP、ALT 活性明显低于模型组（P＜0.01或P＜0.05）。见表1。

表1 清肝降浊方对NAFLD 大鼠血清AST、AKP、ALT 活性的影响（± s，n = 10）

表1 清肝降浊方对NAFLD 大鼠血清AST、AKP、ALT 活性的影响（± s，n = 10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

组别 剂量/（mg/kg） ALT 活性/（U/L） AST 活性/（U/L） AKP 活性/（U/L）正常对照组 — 30.15±7.03## 29.93±4.98## 149.07±18.80##模型对照组 — 75.79±20.24 61.55±20.20 284.31±48.01易善复胶囊组 244.3 48.98±16.71## 40.02±15.54# 216.08±47.37##清肝降浊方组 865.1 38.39±19.50## 36.40±12.00## 154.87±50.50##清肝降浊方组 432.6 45.62±25.23## 39.93±11.07# 181.87±51.10##清肝降浊方组 216.3 54.75±22.86# 44.68±13.49# 197.66±91.67#

2.2 对血清及肝组织中TC、TG 含量的影响 清肝降浊方865.1 mg/kg 和432.6 mg/kg 给药组动物血清及肝匀浆中TC、TG 含量显著低于模型对照组（P＜0.01或P＜0.05）；216.3 mg/kg 给药组动物肝匀浆中TG 含量显著低于模型对照组（P＜0.05）。见表2 和表3。

表2 清肝降浊方对NAFLD 大鼠血清TC、TG、NEFA 含量的影响（± s，n = 10）

表2 清肝降浊方对NAFLD 大鼠血清TC、TG、NEFA 含量的影响（± s，n = 10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

组别 剂量/（mg/kg） 血清TC/（mmol/L） 血清TG/（mmol/L） 血清NEFA/（µmol/L）正常对照组 — 2.48±0.30## 1.83±0.29## 494.70±89.06##模型对照组 — 4.01±0.93 3.15±0.86 862.55±212.37易善复胶囊组 244.3 3.11±0.54# 2.38±0.49# 575.28±133.04##清肝降浊方组 865.1 2.94±0.47# 2.18±0.42## 568.58±124.42##清肝降浊方组 432.6 3.05±0.76# 2.29±0.52# 662.71±140.48#清肝降浊方组 216.3 3.39±0.84 2.47±0.67 754.95±197.69

表3 清肝降浊方对NAFLD 大鼠肝组织中TC、TG 含量的影响（± s，n = 10）

表3 清肝降浊方对NAFLD 大鼠肝组织中TC、TG 含量的影响（± s，n = 10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

肝组织TG/（mmol/L）正常对照组 — 3.61±0.68## 2.95±0.32##模型对照组 — 6.12±0.94 4.08±0.49易善复胶囊组 244.3 5.03±0.84# 3.25±0.57##清肝降浊方组 865.1 4.79±0.89# 3.21±0.44##清肝降浊方组 432.6 4.99±1.19# 3.52±0.60#清肝降浊方组 216.3 5.20±1.07 3.60±0.48#组别 剂量/（mg/kg）肝组织TC/（mmol/L）

2.3 对血清NEFA 含量、肝组织中MDA 含量及SOD活性的影响 NAFLD 肝损伤模型形成后，模型组动物血清NEFA 含量、肝组织MDA 含量明显高于对照组，SOD 活性却明显低于对照组（P＜0.01）。清肝降浊方865.1 mg/kg 和432.6 mg/kg 2 个给药组动物血清NEFA 含量及肝组织MDA 含量均明显低于模型组（P＜0.01 或P＜0.05）；而清肝降浊方制剂865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 给药组动物肝组织SOD 活性却明显高于模型组（P＜0.01 或P＜0.05）。见表2 和表4。

表4 清肝降浊方对NAFLD 大鼠肝组织中SOD、MDA 含量的影响（± s，n = 10）

表4 清肝降浊方对NAFLD 大鼠肝组织中SOD、MDA 含量的影响（± s，n = 10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

肝组织MDA/（nmol/mgprot）正常对照组 — 178.34±45.28## 8.84±1.96##模型对照组 — 69.14±40.61 14.27±2.12易善复胶囊组 244.3 128.11±53.58# 12.02±3.07清肝降浊方组 865.1 162.99±31.54## 11.99±1.29#清肝降浊方组 432.6 151.54±28.18## 12.43±1.35#清肝降浊方组 216.3 115.22±48.52# 13.53±2.60组别 剂量/（mg/kg）肝组织SOD/（U/mgprot）

2.4 对肝组织ATF4、eIF2a、CHOP 蛋白表达的影响 清肝降浊方制剂865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 3 个给药组动物ATF4、CHOP 表达量明显低于模型组（P＜0.05 或P＜0.01）；清肝降浊方865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 2 个给药组动物eIF2a 表达量明显低于模型组（P＜0.05）。见表5。

表5 清肝降浊方对NAFLD 大鼠肝中ATF4、eIF2a、CHOP蛋白表达的影响（± s，n = 10）

表5 清肝降浊方对NAFLD 大鼠肝中ATF4、eIF2a、CHOP蛋白表达的影响（± s，n = 10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

组别 剂 量/（mg/kg） ATF4 eIF2a CHOP正常对照组 — 0.11±0.01## 0.09±0.02## 0.13±0.03##模型对照组 — 0.77±0.18 0.83±0.12 0.98±0.08易善复胶囊组 244.3 0.61±0.12# 0.66±0.14# 0.87±0.10#清肝降浊方组 865.1 0.48±0.13## 0.56±0.13# 0.63±0.13##清肝降浊方组 432.6 0.59±0.09# 0.69±0.11# 0.78±0.11##清肝降浊方组 216.3 0.60±0.12# 0.74±0.10 0.87±0.14#

3 讨论

非酒精性脂肪性肝病是常见的慢性肝病，指除外酒精、药物、病毒或自身免疫性等确切因素而诱发的一系列肝脏疾病，NAFLD 治疗手段受诸多因素影响，如饮食、肠道菌群、代谢、遗传等，全世界总发病率呈现逐年增高态势，因此，有效治疗药物的开发具有重要的临床价值[11-13]。内质网可反映细胞发育、分化、内信号、蛋白质相互作用等细胞内部的变化，在细胞内脂质和胆固醇合成中也起着重要作用，内质网应激是非酒精性脂肪性肝病的关键发病机制[14-15]。本课题通过动物实验观察清肝降浊方对NAFLD的治疗作用，并探讨其与ERS 及其诱导的炎症作用相关的机制。

本研究以高脂饮食喂养大鼠，脂代谢为主要调节因子，其影响是TC、TG 相应变化。结合表2 和表3，清肝降浊方治疗后血清及肝组织中TC、TG 水平均显著降低，证明清肝降浊方具有调节脂代谢的作用；结合表1 和表2 的结果，清肝降浊方可降低ALT、AST、AKP、NEFA 水平，可见清肝降浊方调节肝脂质转运、增强肝功能；表4 实验结果显示清肝降浊方具有抗氧化活性，可通过降低大鼠肝组织MDA 水平，增加SOD 活性等抗氧化酶，改善非酒精性脂肪性肝大鼠肝脏氧化损伤。

PERK/eIF2a/ATF4 信号通路与NAFLD 形成存在着一定关系，在缓解内质网蛋白质代谢的压力，减少细胞损伤方面具有重要意义。真核起始因子2a（eukaryotic initiation factor 2a，eIF2a），蛋白激酶介导的eIF2a 磷酸化可以增加ATF4 翻译，eIF2a 活性降低，可以改善鼠的糖耐量和肝细胞脂肪变性；活性转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4） 是ERS 细 胞凋亡信号转导的关键分子之一，ATF4 除参与许多生理病理过程，可以促进脂肪因子的分泌间接调节脂代谢；C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP），是ERS 介导细胞凋亡的主要转录调节因子，为PERK/eIF2a/ATF4 通路的下游效应因子，其蛋白表达主要以PERK/eIF2a/ATF4 途径为主，研究证实阻断该通路可抑制肝细胞凋亡，调节脂肪代谢[16-18]。本研究中，清肝降浊方能降低 NAFLD 模型大鼠中ERS相关蛋白 ATF4、eIF2a、CHOP 的表达，这提示清肝降浊方对 NAFLD 的改善作用可能是通过反馈性抑制ERS，而有利于缓解肝内脂代谢紊乱。

中药治疗NAFLD 具有显著优势，对NAFLD 具有治疗和预防双重作用，可以通过多种途径进行综合治疗[19-21]。本次研究结果显示，清肝降浊方能减少肝脏中过度沉积的脂质，降低血清肝酶、血脂，肝脂，有一定的保护肝脏、改善脂质代谢紊乱的作用；具有改善肝脏氧化应激状态和脂质过氧化，减轻大鼠肝细胞脂肪变性的作用；明显降低大鼠肝脏组织ATF4、eIF2a、CHOP 蛋白表达量，从而阻断PERK/eIF2a/ATF4信号通路的激活，发挥对NAFLD 的治疗作用，这可能是清肝降浊方防治NAFLD 的机制之一。