禽呼肠孤病毒的分子特征和复制周期

文│吴艳萍（山东省博兴县湖滨镇畜牧兽医站）

禽呼肠孤病毒是Orthoreovirus属5种病毒之一，该属还包括非致融哺乳动物呼肠孤病毒、致融哺乳动物呼肠孤病毒和狒狒呼肠孤，以及从爬行动物中分离的致融病毒。禽呼肠孤病毒和哺乳动物呼肠孤病毒是Orthoreovirus属的两个主要类群，尽管它们有许多共同的分子特征和物理化学特征，但它们在宿主范围、致病性和基因组编码能力以及各种生物学和血清学特性方面有所不同。与哺乳动物呼肠孤病毒不同，禽呼肠孤病毒能引起宿主细胞的融合，但缺乏血凝活性。

禽呼肠孤病毒是鸟类的重要病原体，对家禽业造成相当大的经济损失。病毒最初被发现是导致幼鸡腱滑膜炎的病原体，随后被发现在家禽群中普遍存在，大多数禽呼肠孤病毒导致家禽无症状感染。禽呼肠孤病毒与家禽的多种疾病有关，包括肠道和呼吸道疾病、心肌炎、肝炎和发育迟缓/吸收不良综合征，但病毒的存在与疾病之间的直接联系只有在病毒性关节炎综合征（也称为腱滑膜炎）中才能得到最终证实，其特征是飞节肿胀和腓肠肌肌腱损伤。禽对禽呼肠孤病毒感染的易感性取决于年龄，年龄较大的禽对感染和病毒诱导的病变都更有抵抗力。大多数鸟类是通过粪口途径感染的，尽管也有证据表明是通过呼吸道和垂直传播途径感染的。

一、基因组

禽呼肠孤病毒包含10个双链RNA基因组片段，根据其电泳迁移率，将其分为3个大小类，分别命名为L（大）、M（中）和S（小），有3个L类（L1、L2、L3），3个M类（M1、M2、M3）和4个S类（S1、S2、S3、S4）。L1表达的蛋白为λA，L2表达的蛋白为λB，L3表达的蛋白为λC，M1表达的蛋白为μA，M2表达的蛋白为μB、μBN和μBC，M3表达的蛋白为μNS、μNSC和μNSN，S1表达的蛋白为σC、p10和p17，S2表达的蛋白为σA，S3表达的蛋白为σB，S4表达的蛋白为σNS。迄今为止，根据其血清学特性对禽呼肠孤病毒进行分类的所有尝试都没有成功，因为它们表现出高度的抗原异质性，而在中和试验中表现出相当大的交叉反应。因为分子病毒学家更加关注研究哺乳动物呼肠孤病毒，人们对禽呼肠孤病毒的分子生物学信息知之甚少。

二、蛋白及其作用

禽呼肠孤病毒基因组表达至少12种初级翻译产物，其中8种是结构蛋白，其他4种蛋白是非结构蛋白，非结构蛋白在感染的细胞中表达。由L类基因编码的蛋白质被命名为λ，由M类编码的蛋白质被命名为μ，由S类编码的蛋白质被命名为σ。8种结构蛋白分别为λA、λB、λC、μA、μB、σC、σA和σB，μBN和μBC，则通过翻译后切割其前体μB而产生。M3和S4基因表达2种主要的非结构蛋白，分别称为μNS和σNS，它们在感染细胞的细胞质中很容易被检测到。另外两种非结构蛋白称为p10和p17。在禽呼肠孤病毒感染的细胞中也会产生氨基转移和末端片段被切割的μNS亚型，称为μNSC和μNSN。

λA蛋白被认为形成了包裹病毒基因组和病毒RNA聚合酶的外壳，并被用作后续核心组装的支架。λB蛋白是病毒核心的次要成分，也是惟一一种序列尚不清楚的病毒蛋白质。λC蛋白从禽呼肠孤病毒的内核延伸到外壳。μA蛋白是内核衣壳的一个次要成分。在感染的细胞中合成的大部分μB蛋白在氨基末端附近被切割，产生氨基末端肽，称为μBN，和大的羧基末端蛋白，称为μBC，μB蛋白及其裂解产物均为呼肠孤病毒颗粒外壳的结构成分。μNS蛋白是非结构蛋白，感染细胞中存在的一定比例的μNS蛋白在N末端附近被切割，产生氨基末端片段为μNSN，和一个羧基末端蛋白，命名为μNSC。σA蛋白是内核壳的一种成分。σB蛋白是病毒外壳的主要成分。σC蛋白能引发呼肠孤病毒特异性中和抗体，σC蛋白在转染细胞中细胞内表达时会导致细胞凋亡，但对禽呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡的作用尚不清楚。非结构蛋白p10是在禽呼肠孤病毒感染的细胞中合成的，是一种跨膜蛋白。非结构蛋白p17在感染细胞的细胞核中积累，在禽呼肠孤病毒生命周期和病毒与宿主相互作用中所起的作用尚不清楚。非结构蛋白σNS存在于受感染细胞细胞质中的大型核糖核蛋白复合物中，可能在病毒RNA包装和复制中发挥关键作用。

三、禽呼肠孤病毒颗粒及其与宿主细胞的相互作用

禽呼肠孤病毒颗粒包含10个双链RNA片段的基因组，包裹在2个蛋白外壳内。除了10个基因组片段外，还含有许多功能未知的、小的、富含腺嘌呤的单链寡核苷酸。蛋白μB、μBC、μBN、σB和σC是外层蛋白外壳的组成部分，而蛋白λA、λB、μA和σA是内层蛋白外壳的组成部分。λC蛋白是两层蛋白质外壳的组成部分，从内核延伸到外壳。

通过电子冷冻显微镜和图像重建对禽呼肠孤病毒138的结构进行了检测，证明了禽呼肠孤病毒和哺乳动物呼肠孤病毒在结构上的相似性，从主要表面蛋白σB的顶部测量的禽呼肠孤病毒粒子的总直径为85.7纳米，仅比先前报道的哺乳动物呼肠孤病毒粒子的直径大0.3纳米。

与哺乳动物的病毒颗粒不同，当禽呼肠孤病毒颗粒悬浮在无盐中性pH缓冲液或酸性缓冲液中时，以及当病毒悬浮液经历冷冻和解冻循环时，它们非常不稳定，并迅速失去传染性。纯化的禽呼肠病毒在中性pH值下，在0.15 M盐缓冲液中，在4℃下可稳定保存数月。禽呼肠孤病毒在40℃孵育后失去了外层蛋白外壳，鸡的体温为39.5℃，禽呼肠孤病毒粒子在自然宿主温度下释放的外层蛋白外壳可能对病毒在禽宿主体内复制的早期阶段产生积极影响，这可能有助于病毒渗透到肠细胞。

与许多其他病毒一样，禽呼肠孤病毒感染会引发细胞的胞内凋亡程序，表现为DNA断裂成寡核小体DNA，核糖体RNA降解，以及细胞质内存在组蛋白相关DNA片段。禽呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡似乎是在病毒复制周期的早期阶段触发的，因为细胞凋亡的特征是在感染早期检测到的，而且细胞内病毒基因表达受到抑制时仍可触发细胞凋亡，说明细胞凋亡不需要病毒基因表达、病毒mRNA和非结构蛋白诱导。禽呼肠孤病毒感染会引起细胞-细胞融合，而细胞-细胞融合对禽呼肠孤病毒在感染动物体内的复制很重要，因为它促进了病毒的传播，并允许病毒在不暴露于宿主免疫防御的情况下传播到邻近的未感染细胞。与包膜融合性病毒不同，禽呼肠孤病毒从受感染细胞内部诱导合胞体的形成，这表明细胞-细胞融合是由新合成的病毒产物引发的，与病毒渗透无关。禽呼肠孤病毒对宿主干扰素具有抵抗能力，对鸡干扰素的抗病毒作用具有高度耐药性，表明这些病毒能利用未知策略来抵消这种细胞因子的抗病毒作用。

四、复制周期

禽呼肠孤病毒的细胞外附着是由外衣壳蛋白σC和细胞表面受体之间的特异性相互作用介导的。禽呼肠孤病毒不仅能在禽细胞中，而且能在大多数哺乳动物细胞中附着和复制，表明禽呼肠孤病毒受体是一种普遍存在的细胞表面蛋白。但哺乳动物呼肠孤病毒不附着在鸡胚成纤维细胞上。

包膜病毒通过脂质包膜与细胞质膜融合而进入细胞，禽呼肠孤病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，去除外衣壳蛋白，从而产生具有跨膜能力的亚病毒颗粒。

病毒基因表达始于所有10种病毒mRNA的合成，禽呼肠孤病毒RNA聚合酶的活性位点被认为包含在蛋白λB中。禽呼肠孤病毒多肽的合成是在感染早期检测到的，细胞内病毒蛋白的水平存在相当大的差异，其中μBC、σB和σNS含量最高，而λB和μA蛋白含量最低。这表明禽呼肠孤病毒的基因表达主要在翻译水平受到调控，这可能与不同病毒mRNA的特定结构和特征有关。

新的禽呼肠孤病毒颗粒都聚集在细胞质密集包涵体中，这些包涵体被称为病毒包涵体或“病毒工厂”，呈球形，没有膜和细胞器，含有结构蛋白和非结构蛋白，以及部分和完全组装的颗粒。病毒蛋白在转染细胞中的表达表明μNS是禽类呼肠孤病毒蛋白中惟一在单独表达时能形成包涵体的蛋白，并且该蛋白介导σNS和λA选择性募集到包涵体中。在禽呼肠孤病毒感染的细胞中，所有的病毒蛋白都存在于病毒包涵体中。一些蛋白最初通过μNS关联被运送到病毒包涵体中，而另一些蛋白随后通过与未知因素的相互作用被输入。

目前还没有研究解决控制禽呼肠孤病毒颗粒从感染细胞释放的分子机制，但由于其渗透性和细胞融合活性，非结构p10蛋白似乎很可能在病毒释放和传播到邻近细胞中起关键作用。