5-氨基咪唑类化合物的制备及其活性研究

陈彩萍，章潮军，王小平，徐作武，徐慧婷

（1.浙江昌海制药有限公司，浙江 绍兴 312000；2.浙江可明生物医药有限公司，浙江 绍兴 312000；3.浙江绍兴文理学院 化学化工学院，浙江 绍兴 312000；4.脂溶性维生素浙江省工程研究中心，浙江 绍兴 312000）

含氮杂环化合物种类繁多，数量庞大，在自然界中广泛分布，许多天然含氮杂环化合物在动植物体内起着重要的生理作用[1-3]。5-氨基咪唑是一类具有多种生物活性的杂环类化合物[4-9]，广泛用于抗血小板、抗菌、抗炎、抗癌等药物的研发，在医药领域具有重要的应用价值，同时它还是合成药物活性分子和天然生物活性分子的重要合成砌块，如被用于5-氨基咪唑核苷酸的生物合成，咪唑啉杀虫剂的合成，促性腺激素释放激素受体拮抗剂的合成等。5-氨基咪唑类化合物在药理学方面表现出广泛的生物活性[10-11]，如抗癌活性，在脂肪细胞中通过WNT/B-连环蛋白通路抑制脂肪生成，通过AMP-活化的蛋白激酶依赖路径诱导细胞色素P450 4F2的表达和在骨骼肌中增加去乙酰化酶的表达。

5-氨基咪唑在化学和生物方面具有相当大的功能性，但是，传统的合成5-氨基咪唑的方法[12-13]都存在着或多或少的缺陷，大都存在着原子经济性和步骤经济性差、产率低、反应条件相对苛刻以及副产物多、后处理困难等不足，不适于大规模的工业生产，因此开发一种新的绿色、高效的合成5-氨基咪唑的方法就显得尤为重要。

目前，文献报道的5-氨基咪唑类化合物的合成方法主要有以下5 种：①硝基还原或者叠氮基还原法；②1-氨基-1，2，4-三氮唑法；③微波合成法；④原乙（甲）酸三乙酸酯法；⑤异腈法。

利用还原法[14-15]合成5-氨基咪唑的主要原料是5-硝基咪唑，或者5-叠氮基咪唑，通过使用Pd/H2催化剂对反应进行催化还原，从而得到所需要的5-氨基咪唑，反应方程式如图1所示。由于所使用的原料为5-硝基咪唑或5-叠氮基咪唑，原料来源不便，且使用Pd/H2催化，成本较高，不适于大规模的工业生产，而且H2易燃，在反应过程中极易引发爆炸，存在安全隐患。此外，使用5-叠氮基咪唑还原法制备5-氨基咪唑时，产率较低，仅有71%。

图1 还原法合成5-氨基咪唑的反应式

Donskaya O V 课题组[16]利用该方法合成5-氨基咪唑的主要原料是4-硝基咪唑和1-氨基-1，2，4-三氮唑，使用强碱叔丁醇钾为催化剂进行反应，反应方程式如图2所示。虽然该方法也可以成功合成5-氨基咪唑，且原料相对而言较为廉价，反应过程也比较安全，但是还是存在一定的问题，如产率太低，仅有39%，因此也不适于大规模的工业生产。

图2 1-氨基-1，2，4-三氮唑法合成5-氨基咪唑的反应式

Soh C.H.等[17]首先使用腈类化合物和原硫酸二乙酯在微波条件下80℃高收率合成硫代酰胺1，接下来在氯仿中80℃与苄溴反应，生成硫代亚胺类化合物2，然后再与氨基乙腈类化合物反应生成5-氨基咪唑化合物3，反应方程式如图3 所示。该方法与传统的合成方法相比，反应时间大大缩短，整个反应过程仅需25 min。但是由于该方法整个过程是在微波条件下进行，存在安全隐患。

图3 微波法合成5-氨基咪唑的反应式

Ray S.与Das A.等[18]把2-氨基-2-氰基乙酰胺在干燥蒸馏的乙腈中加入原甲酸三乙酯，加热回流一段时间后冷却到室温时，加入伯胺进行反应，在容器表面会产生沉淀，将此产物用乙腈洗涤后得到粗产物，该法仅有一步实验流程，较为快捷，但是整个反应过程需要长时间的加热回流，产物沉淀之后，也需要用乙腈多次冲洗，后续操作过于麻烦，反应方程式如图4所示。

图4 原乙（甲）酸三乙酸酯法合成5-氨基咪唑的反应式

John T.Hunt 等[19]使用异硫脲1 和异氰乙酸乙酯钾盐2 在六甲基磷酰三胺中混合，以氯化亚铜为催化剂。在室温下反应几小时得到所要产物，但是在实验过程中，总是会产生相当多碳二亚胺的中间产物，比如，反应物2在标准条件下进行反应，实验后所得的产物产率只有30%，而且反应生成两种产物，选择性较差。因此，此法虽然能在常温下，利用一个合成步骤合成产物，但是产率极低，选择性较差，反应方程式如图5所示。

图5 异氰法合成5-氨基咪唑的反应式

本文提供一种一锅法制备5-氨基咪唑化合物的方法，合成系列化合物并通过MTT 比色法对其生物活性进行检测。合成路线如图6：以芳基硫脲和异氰为起始原料，DUB 为催化剂，制备5-氨基咪唑化合物，并对其进行表征分析。

图6 5-氨基咪唑化合物的制备路线

1 实验部分

1.1 仪器

核磁共振仪，AVANCE DMX ⅡⅠ400M，TMS内标，Bruker 公司；熔点仪，MP30，梅特勒；高分辨质谱仪（HRMS），岛津。

1.2 试剂（表1）

表1 试剂

1.3 5-氨基咪唑化合物的制备

于25 mL 的圆底烧瓶中加入磁力搅拌子，芳基硫脲（1.2 mmol），异腈（1.0 mmol）和DMF（5 mL），随后向上述体系中缓慢加入DBU（2.0 mmol），于室温下搅拌反应24 h，点板跟踪直至反应完全。反应结束后，往反应体系中加入饱和食盐水溶液和乙酸乙酯进行萃取，取有机层，反复萃取3次，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得到粗品，再经柱色谱分离纯化（乙酸乙酯∶石油醚=1∶10）得目标5-氨基咪唑衍生物，详见表2。

表2 产物及其收率

产物的结构为：

化合物1表征数据：产品为白色固体，收率65%，熔点198.6℃～200.9℃。1HNMR（500 MHz，CDCl3）: δ 7.87（d，J = 8.5 Hz，2H），7.28-7.27（m，2H），7.14-7.09（m，2H），7.01-6.95（m，2H），6.92-6.91（m，1H），6.81-6.75（m，2H），6.66（s，1H），6.42（d，J=7.0 Hz，1H），2.40（s，3H），2.13（s，3H），2.10（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）: δ 143.94，140.12，139.16，138.92，134.85，134.74，133.27，130.99，130.44，129.77，129.51，127.53，127.25，126.58，126.12，125.61，123.62，119.95，21.62，17.78，17.57。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C24H24N3O2S [M+H]+:418.158 4，found: 418.158 5。

化合物2表征数据：产品为浅黄色固体，收率60%，熔点200.8℃～203.3℃。

1HNMR（500 MHz，CDCl3）: δ 7.81（d，J = 8.5 Hz，2H），7.48（s，1H），7.23（d，J=8.0 Hz，2H），7.17-7.13（m，3H），6.91-7.86（m，2H），6.61（d，J = 7.5 Hz，1H），6.38（d，J=7.5 Hz，1H），6.34（s，1H），2.39（s，3H），2.25（s，3H），2.09（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3） δ 144.06，142.02，139.72，138.81，138.75，136.58， 134.82， 134.77， 129.80， 129.51， 129.31，128.82， 127.66， 127.59， 124.94， 123.06， 121.29，118.75，115.11，21.71，21.30，21.29。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C24H24N3O2S [M+H]+:418.158 4，found: 418.158 0。

化合物3表征数据：产品为黄色固体，收率69%，熔点195.6℃～197.6℃。

1HNMR（500 MHz，CDCl3）: δ 7.85（d，J = 8.5 Hz，2H），7.72（s，1H），7.55（d，J=8.5 Hz，2H），7.53（s，1H），7.34-7.32（m，2H），6.93-6.88（m，3H），6.70（s，1H），6.69-6.65（m，1H），6.45（d，J = 8.0 Hz，1H），2.38（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 144.90，140.11，138.76，135.31，134.98，133.69，133.06，132.58，131.04，129.85，129.38，128.35，128.21，127.99，123.66，120.54，117.52，113.48，21.66。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C22H17Br2N3O2S [M+H]+:544.940 8，found: 544.940 3。

化合物4 表征数据：产品为浅黄色固体，收率79%，熔点145.0℃～147.6℃。

1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ: 7.41-7.37（m，3H），7.28-7.26（m，2H），7.21（d，J=8.5 Hz，2H），7.11（d，J = 8.0 Hz，2H），6.98-6.78（m，2H），6.07（s，1H），4.43-4.38（m，2H），1.43-1.40（m，3H）;13C NMR（CDCl3，125 MHz） δ: 175.36，150.70，144.22，142.62，138.59，136.09，129.32，129.00，127.59，124.27，122.09，117.62，63.24，14.75。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C18H17N3O2[M+H]+:307.132 1，found: 307.131 5。

化合物5 表征数据：产品为白色固体，收率73%，熔点148.0℃～149.1℃。

1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ:7.41（s，1H），7.14（d，J=8.5 Hz，2H），7.06（d，J=8.5 Hz，2H），6.80（d，J=8.0 Hz，2H），6.69（d，J = 8.0 Hz，2H），6.0（s，1H），4.39（q，J=8.0 Hz，2H），2.37（s，3H），2.26（s，3H），1.39（q，J=8.0 Hz，3H）.13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ:174.86，150.12，143.88，139.93，138.83，136.92，132.13，131.47，129.52，127.56，124.12，117.82，63.55，29.82，29.27，14.50。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C20H21N3O2[M+H]+:335.163 4，found: 335.163 8。

化合物6 表征数据：产品为黄色固体，收率77%，熔点123.8℃～125.0℃。

1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ:7.46（s，1H），7.45（d，J=8.5 Hz，2H），7.22（d，J=8.0 Hz，2H），7.18（d，J=9.0 Hz，2H），7.15（d，J = 8.5 Hz，2H），6.35（s，1H），4.37-4.26（m，2H），1.39-1.36（s，3H）.13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ:175.05，144.60，141.95，138.00，134.97，132.03，129.88，127.68，125.81，123.05，118.44，61.56，14.51。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C18H15Br2N3O2[M+H]+:462.953 1，found: 462.953 5。

1.4 MTT比色法测定化合物的抗细胞增殖活性

将化合物1～6 用DMSO 溶解后稀释，将细胞株SW620（人结肠癌细胞）、MKN45（肺癌细胞）、MKN-28（胃癌细胞）、T47D（人乳腺癌细胞）、3AO（卵巢癌细胞）在96 孔板上种入4 000 个/200 μL/孔，每孔加入化合物2 μL，终浓度分别为100 μM、50 μM、20 μM、10 μM、5 μM、2.5 μM，在细胞培养箱（37℃，5% CO2）中孵育72 h，以DMSO（1%）为空白对照。72 h 后加入终浓度为0.25 mg/mL 的MTT，于细胞培养箱中孵育4 h，之后吸干溶剂，每孔加入100 μL的DMSO，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值（OD 值），计算药物对细胞增殖的抑制率以及被测样品的IC50值，公式如下：

抑制率=[1-（测试样品的OD 值-空白OD 值）/（阴性对照的OD值-空白OD值）]*100

lg IC50=Xm-I[P-（3-Pm-Pn）/4]，其中，Xm=lg[最大剂量]，I=lg[最大剂量/相临计量]；P 为阳性反应率之和，Pm为最大阳性反应率，Pn为最小阳性反应率，结果如表3所示。

表3 化合物（1～5）对不同肿瘤细胞株的IC50

实验结果表明，该系列化合物对肿瘤细胞活性有较强的抑制功能，特别是化合物1 对SW620（人结肠癌细胞）、MKN45（肺癌细胞）、MKN-28（胃癌细胞）均有明显的效果。

2 结论

本文设计的一锅法制备5-氨基咪唑化合物的合成路线有以下优势：①原料简单，反应条件温和；②实验步骤少，反应操作方便，因为该实验为一锅煮的方法，减少了中间体的分离纯化步骤，降低了成本；③收率高，具有推广应用价值；同时，5-氨基咪唑类化合物在医药领域具有重要的应用价值。本文通过MTT比色法测定了化合物的抗细胞增殖活性，为其在医药方面的应用提供了思路。