烟酰胺单核苷酸醇沉干燥工艺研究及微观结构观察

2024-03-05史玉龙王本超濮梦华

安徽化工 2024年1期

史玉龙，陈洋，王本超，谷平，濮梦华

（江西海文生物科技有限公司，江西赣州 342400）

烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide，NMN），是一种自然存在的生物活性核苷酸[1]。在人体细胞能量生成中扮演重要角色，是细胞能量的重要来源之一，其广泛参与人体多项生化反应，与免疫、代谢息息相关[1]。近年研究发现，人为补充NMN 能够修复脑损伤、改善胰岛功能、保护心脏免于缺血再灌注损伤、修复脑线粒体呼吸缺陷，对老年退行性疾病、视网膜退行性疾病、Ⅱ型糖尿病、脑出血等均具有一定治疗作用[2]。NMN广泛存在于毛豆、西兰花、真菌、虾等天然食物中，但是食用天然食物摄入NMN 的量，远不能达到人体健康所需要的量[3]。因此将其应用于加工食品中，将对改善人体健康、预防疾病等起到重要的作用。

分离提纯是NMN 工业化生产的关键工序之一，直接决定NMN 产品的质量。由于干燥对产品的颜色、结构和成分均有不同程度的影响，因而对NMN 生产成本和产品质量也有重要影响。目前热风干燥[4]、喷雾干燥[5]、真空冷冻干燥[6]和微波干燥[7]等干燥方式虽已广泛应用于各种产品干燥中，但上述几种干燥方式应用于NMN 干燥中均存在难以解决的弊端：热风干燥是目前最常用的干燥方式，具有操作简单、便于控制的特点，但对于热敏性产品具有较大局限性[8]；真空冷冻干燥虽然对产品的颜色、结构和成分保持较好，但该方法获得产品水分不易达标，且极易吸潮[6]；喷雾干燥虽然具有较高的干燥速率，但对于热敏性产品需要严格控制温度的变化，进风温度过高易导致有效成分降解，过低可能导致产品含水量过高[9]；微波干燥虽然速度快，但是在干燥过程中加热不均匀，会导致物料部位焦化[10]。而当前文献报道获得NMN 成品的可行方法有醇沉后真空干燥[11]、冷冻干燥法[12]，其中醇沉法的原理是利用某些成分在水和醇中的溶解度差异，加入醇以后使其溶解度变小而沉淀[13-16]，得到晶体后进行真空干燥，继而获得NMN 成品。该方法是析晶得到烟酰胺单核苷酸相对简单的方法。

本文鉴于烟酰胺单核苷酸易溶于水，微溶于醇类的性质，对醇沉分离纯化烟酰胺单核苷酸的工艺操作条件进行优化，结合真空干燥方式获得NMN成品，并利用扫描电镜观察醇沉得到的烟酰胺单核苷酸的微观结构，分析该工艺的可靠性，为工业化分离纯化烟酰胺单核苷酸提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

高效液相色谱仪，Agilent 1260，安捷伦；电子天平，梅特勒-托利多测量技术有限公司；真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；水浴锅，常州高德仪器制造有限公司；20 L 结晶釜；扫描电镜，台式TM3030 型，日立高新技术公司；喷雾干燥机，上海继谱电子科技有限公司；卡尔费休水分测定仪，泰州市银河仪器厂。

烟酰胺单核苷酸，纯度≥99.5% ，批号BT05H122L115，邦泰生物工程（深圳）有限公司；烟酰胺单核苷酸，自制，安徽瑞邦生物科技有限公司；乙醇；无水磷酸氢二钠；二水磷酸二氢钠；超纯水；甲醇；卡尔费休试剂（含吡啶）。

1.2 烟酰胺单核苷酸的制备

1.2.1 对照品溶液的制备

称取0.2 g（精确至0.1 mg）购买的NMN 样品于100 mL容量瓶中，待进样。

1.2.2 供试品溶液的制备

采用本公司生物酶催化法得到NMN 反应溶液，经离子交换树脂过滤提纯，得到NMN粗产物，再利用纳滤（100 D）进行浓缩，最终经电渗析脱盐和活性炭脱色后获得NMN溶液。

1.3 醇沉工艺研究

1.3.1 醇沉体积分数考查

取3 份15 g/L 的NMN 供试品，分别加入乙醇，使乙醇终体积分数分别达到50%、60%、70%，50 r/mim 室温搅拌1 h，离心，NMN 湿料在-0.08 MPa、50℃下干燥后检测。

1.3.2 醇沉时间考查

取3 份15 g/L 的NMN 供试品，分别加入乙醇，使乙醇终体积分数70%，50 r/min 室温搅拌1 h、2 h、3 h，离心，NMN湿料在-0.08 MPa、50℃下干燥后检测。

1.3.3 醇沉温度考查

取3 份15 g/L 的NMN 供试品，分别加入乙醇，使乙醇终体积分数70%，50 r/min 在4℃、10℃、25℃下搅拌1 h，离心，NMN湿料在-0.08 MPa、50℃下干燥后检测。

1.3.4 醇沉溶液回收

为了减少乙醇的使用量和回收底液中的NMN，减轻危废溶剂处理压力和提升NMN 的收率，采用减压蒸馏回收乙醇。42℃，转速40 r/min，-0.1 MPa 开始减压蒸馏。

1.4 干燥工艺研究

1.4.1 喷雾干燥

利用15 g/L 的NMN 供试品直接进行喷雾干燥，风机速度60%，进料速度设为10 mL·min-1，进风温度为120℃，收集罐温度梯度设置为90℃、95℃、100℃，结束后收集样品检测水分、NMN纯度和含量等指标，确定该干燥方式的效果。

1.4.2 真空干燥

将上述离心得到的醇沉湿品于真空度为-0.08 MPa 的条件下，分别控制干燥温度为40℃、50℃、60℃，干燥6 h 结束后，收集样品检测水分、NMN 纯度和含量等指标，确定该干燥方式的效果。

1.5 扫描电镜样品的制备

取约10 mg 上述两种样品粘在样品台上，用吸耳球轻轻将散落在样品台上的细小粉粒吹除。将切好的样品用导电胶粘在金属平台上镀膜，用台式扫描电镜在15.0 kV加速电压下观察。

1.6 检测方法

1.6.1 HPLC检测

参考文献[17]确定NMN 的HPLC 检测方法。称取0.02～0.03 g（精确到0.01 mg）样品于100 mL 容量瓶中，准确记录称样质量m1，并用超纯水定容至刻度线，充分摇匀。称取0.02～0.03 g（精确至0.01 mg）标样于100 mL容量瓶中，准确记录称样质量，并用超纯水定容至刻度线，充分摇匀。迅速进样计算其含量。称取0.2 g（精确至0.1 mg）样品于100 mL 容量瓶中，待进样，采用液相色谱法，依据记录的色谱图，按峰面积归一化法计算其纯度。色谱条件：色谱柱：Eclipse plus C18 4.6*250 mm*5 μm；流动相：无水磷酸氢二钠+二水磷酸二氢钠+水=8 g+8 g+4 L；检测波长：254 nm；流速：1 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL。

1.6.2 卡尔费休水分测定法

参照GB 8571—2002的测定方法[18]处理。

2 结果与分析

2.1 烟酰胺单核苷酸的醇沉

2.1.1 醇沉体积分数考查

由表1可见，随着乙醇含量的增加，NMN纯度、含量和收率逐渐增加。根据NMN的纯度指标和市场价格确定生产效益，最终确定乙醇终浓度为70%。

表1 醇沉体积分数考查

2.1.2 醇沉时间考查

表2表明，随着搅拌时间的延长，NMN纯度、含量和收率逐渐增加，结合工业生产实际以及能耗等因素综合考虑，最终确定醇沉搅拌时间为1 h。

表2 醇沉时间考查

2.1.3 醇沉温度考查

表3 表明，随着温度的降低，NMN 的含量和纯度并无较大差异，但收率有所提高，结合生产效益确定最终醇沉温度为4℃。

表3 醇沉温度考查

2.1.4 验证实验

综合单因素实验结果，确定最佳醇沉工艺为乙醇终浓度70%，4℃静置1 h，离心得醇沉物，在-0.08 MPa和50℃的条件下干燥得到NMN成品，3 次验证实验结果见表4。

表4 验证实验结果

结果表明，NMN醇沉后平均纯度为99.58%，平均收率为97.05%，结果较为稳定，说明该醇沉工艺稳定可行。

2.1.5 醇沉溶液回收（表5）

表5 醇沉溶液回收结果

经过醇沉析晶后，醇沉废液中还含有3%的NMN。为增加收率，在-0.1 MPa 和温度42℃条件下进行NMN和酒精的回收，发现蒸馏出的酒精含量可达90%，NMN含量可浓缩到12%，且并未出现明显分解，因此确定醇沉溶液蒸馏回收条件可行。

2.2 烟酰胺单核苷酸的干燥

2.2.1 喷雾干燥

由表6 可见，随着喷雾干燥收集罐温度的升高，NMN 纯度和含量逐渐降低，证明干燥过程中NMN 分解，且水分并未随着温度的升高而减少。

表6 喷雾干燥结果

2.2.2 真空干燥

通过NMN 醇沉湿品在不同温度条件下干燥发现，在40℃下NMN 纯度较高，但水分含量也较高；60℃下NMN虽然水分达标，但纯度和含量降低。表7中50℃条件下NMN 的含量、纯度和水分都达到了团体标准T/CASME 011—2021 中优品的要求。因此确定该干燥工艺可与醇沉工艺结合，可稳定得到NMN优品。

表7 醇沉样品真空干燥结果

2.3 醇沉样品的微观结构

由图1（a）（c）可知，醇沉后真空干燥的NMN 成品结构为针状，水分更易干燥。喷雾干燥的单个NMN表面光滑平整呈球状，大量细碎小颗粒附着在其表面，NMN成品颗粒大小分布极其不均匀，且颗粒表面未出现气孔，见图1（b）（d），可能由于过低的喷雾温度未能使得内部受热，最终导致液滴中的水分不能充分蒸发所致。