单根纳米线电极的制备与表征

钟琳

（湖北大学 化学化工学院，湖北 武汉 430061）

细胞是生命体的基本结构和功能单元，许多生命活动都发生在单细胞甚至亚细胞水平上。在众多纳米尺度的研究技术中，基于纳米电极的电化学方法具有高灵敏度、高时空分辨率和强大的定量能力等优点，已被广泛应用于单细胞研究领域中。例如，纳米电极具有极小的尺寸，在探索亚细胞和细胞生物过程（如细胞内事件和细胞间通讯过程）的同时，能够很好地维持细胞活力。此外，通过将纳米电极与其他平台（如扫描电化学显微镜、原子力显微镜和扫描离子电导显微镜）进一步结合，还可以实现同时获取细胞的电化学信号和形貌信息[1-3]。尽管基于纳米电极的电化学方法已经取得了巨大的进步，但纳米电极的发展仍然遇到一些不可避免的阻碍，如制备过程复杂耗时、技术难度高以及机械稳定性较差等。

银纳米线（Ag NWs）是一种近期发展迅速的一维纳米材料，其导电性和机械性能良好，因此可作为基底材料用于制备纳米电极[4-5]。目前已有多种合成Ag NWs的方法，包括模板法、微波加热法、紫外线照射法和多元醇法等。与其他合成方法相比，多元醇法具有工艺简单、尺寸均匀、分散性好以及结构可控等优点[6-7]。因此，通过控制反应条件或者引入控制性物质（如不锈钢片、二价或三价铁盐、一价或二价铜盐、硫离子和氯离子等），可以大规模地合成具有不同长径比的Ag NWs。

本文首先采用多元醇法合成Ag NWs，优化其反应条件，随后在碳纤维微电极表面靠取单根Ag NW 以制备单根银纳米线电极（Ag NWE），电极制备过程如图1所示。最后，对制备的Ag NWE 进行形貌、电化学和单细胞插入表征，证明其具有合适的一维尺寸、良好的电化学性能和机械性能，这不仅促进了纳米电极的发展，还为单细胞研究提供了一种极具潜力的纳米工具。

图1 银纳米线电极（Ag NWE）制备过程示意图Fig.1 Schematic diagram of the preparation process of silver nanowire electrode（Ag NWE）

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

硝酸银（AgNO3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Mw=1 300 000），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇（EG）、二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）、乙醇（C2H6O）、铁氰化钾［K3Fe（CN）6］、氯化钾（KCl），国药集团化学试剂有限公司；六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O），北京伊诺凯科技有限公司；导电银胶AS6880，浙江善仁新材料科技有限公司；聚二甲基硅氧烷（PDMS），道康宁有限公司；玻璃毛细管，内径Φ 0.5 mm，成都华西医科大学仪器厂；高分化的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12），赛百慷生物技术股份有限公司。

1.2 分析测试仪器

Sigma 500 扫描电子显微镜，德国蔡司；MF-830 抛光仪，日本成茂；MP-225 电动微操纵器，美国Sutter；Ti2-U 倒置荧光显微镜，日本尼康；CHI 660E 电化学工作站，上海辰华仪器有限公司。

1.3 合成与优化银纳米线

采用改进的多元醇法[8]合成Ag NWs。首先将5 mL 0.05 mol/L AgNO3/EG 溶液和5 mL 0.1 mol/L PVP/EG 溶液加入到聚四氟乙烯内胆中混合，在80℃下边加热边搅拌，然后将10 μL 0.025 mol/L FeCl3溶液加入至上述混合溶液中，在160℃下孵育10 h。最后，用去离子水清洗沉淀物5 次以去除PVP 残留物，12 000 r/min 离心5 min后将产物分散在乙醇中。

为了探究AgNO3与PVP之间的摩尔比对Ag NWs形貌尺寸的影响，将上述过程中AgNO3和PVP的摩尔比从1∶2 提高至1∶6。同时根据文献[9]所述，还可以通过改变金属离子的种类来合成Ag NWs，以探究其对Ag NWs形貌尺寸的影响。合成过程如下：首先，将圆底烧瓶中20 mL 的EG 溶液在160℃的油浴条件下预热5 min，然后向溶液中添加1.5 mL 8 mmol/L 的CuCl2溶液，10 min后向溶液中加入10 mL 0.12 mol/L的AgNO3和0.36 mol/L PVP的混合物。反应25 min后，沉淀以2 000 r/min的转速离心5 min，并用丙酮和乙醇洗涤。最后，将Ag NWs分散到乙醇溶液中，备用。

1.4 制备银纳米线电极

Ag NWE 的制备过程如图1 所示。首先，采用火焰蚀刻的方法[10]制备了长度约为10 ～20 μm、尖端直径约为1 μm 的碳纤维电极（CFE）。然后，在抛光仪的辅助下，将导电银胶薄薄地涂覆在暴露的碳纤维上。随后，将CFE的尖端放入Ag NWs分散液中靠取数次，在抛光仪下观察是否成功蘸取单根Ag NW，反复蘸取直至成功为止。靠取成功后，将Ag NW 与碳纤维的连接处在抛光仪的铂丝上稍加热，然后将其置于60℃烘箱中干燥，以加固单根Ag NW 与碳纤维之间的连接。然后将干燥后的电极通过橡皮泥水平固定在抛光仪的横向玻璃夹上，抛光仪的竖向玻璃夹上竖直放置装有PDMS的玻璃毛细管（尖端直径约为2 μm），用硅胶毛细管和注射器将玻璃毛细管中的PDMS压出挂在毛细管尖端，并将PDMS修饰在碳纤维上以实现绝缘，使电极仅暴露出Ag NW 作为电极活性区域。最后，将其放置于60℃烘箱中干燥即完成电极的制备。

1.5 细胞培养与单细胞插入实验

PC12 细胞在RPMI-1640 培养基（Gibco，补充10%胎牛血清和2% 100 U/mL 青霉素-链霉素混合溶液）中培养，培养箱保持在37℃和5% CO2条件下。当培养瓶中的细胞密度达80%～90%时，按传代比例为1∶4进行传代（培养瓶中的细胞一般3～4天传代一次，每两天更换一次培养基）。

在进行单细胞插入实验之前，PC12 细胞在35 mm培养皿中培养2～3 天，并且培养皿中的培养基额外添加了50 ng/mL 的NGF。随后，用PBS 溶液取代培养基，将准备的细胞培养皿用于单细胞插入实验。具体过程如下：将Ag NWE 安装在电动微操纵器上，在倒置荧光显微镜的观察下，通过微操纵器将电极尖端的Ag NW精准地插入到单个PC12细胞内。

2 结果与讨论

2.1 银纳米线的表征

在采用多元醇法合成Ag NWs 的过程中，AgNO3和PVP 之间的摩尔比、金属盐种类等都会对Ag NWs 的形貌尺寸产生影响。因此，在制备Ag NWE 之前，首先对合成Ag NWs的反应条件进行优化，同时通过倒置荧光显微镜对不同摩尔比的AgNO3与PVP 以及不同金属盐合成的Ag NWs进行形貌表征。如图2 a所示，当AgNO3与PVP之间的摩尔比为1∶2，金属盐为FeCl3时，Ag NWs的长度较短，大约为15 μm，并且其产率较低。随后，通过提高PVP 浓度将摩尔比调节至n（AgNO3）∶n（PVP）=1∶6，从图2 b中可以观察到，Ag NWs的长度有所增加，但其产率并没有显著提高，这可能是因为过量的PVP完全包覆了银颗粒晶种，导致其无法在一维方向上优势生长[11]。最终，将AgNO3与PVP之间的摩尔比调节为1∶3，如图2c 所示，产物以Ag NWs 为主，并且其在分散液中具有较好的分散性。另外，文献表明Fe3+和Cu2+被EG还原后能有效清除反应体系中的氧，使一维生长的银颗粒晶种不会因为氧化而溶解，同时Fe3+作用要强于Cu2+，但还原后的金属离子可能会占据银颗粒晶种上的高能量位点缺陷，从而导致溶液中Ag 原子无法在这些高能量位点缺陷上聚集和生长[12]，所以在合成Ag NWs 时选择CuCl2作为金属盐。

图2 不同反应条件下合成的Ag NWs 在倒置荧光显微镜下的图像Fig.2 Images of Ag NWs synthesized under different reaction conditions under inverted fluorescence microscopy

扫描电镜分析表征Ag NWs 的形貌见图3，Ag NWs的长约30 μm，直径约Φ200 nm，前后均一。结果证明，通过优化反应条件成功制备了符合形貌要求的Ag NWs。

图3 Ag NWs（对应于图2 c）的扫描电镜图像及其放大图像Fig.3 SEM images of Ag NWs（corresponding to Fig.2c）and their enlarged images

2.2 银纳米线电极的表征

采用简单的靠取法制备了以CFE 为基底的Ag NWE，从图4 a 可以看出，Ag NW 与碳纤维连接良好，并且暴露于尖端的工作段Ag NW 呈笔直状且直径均一，其长度为20 μm 左右，这确保了电极在细胞内检测时有足够的插入深度，符合纳米电极应具备的尺寸要求。为了进一步从功能上验证制备的Ag NWE 是否成功电连接，通过循环伏安法对其进行了电化学性能表征。将制备的CFE 和Ag NWE 分别置于含有1 mmol/L K3Fe（CN）6的1 mol/L KCl溶液中进行循环伏安法测试，如图4 b 所示，CFE 和Ag NWE 的循环伏安都呈“S”型，符合超微电极的循环伏安特征。但与CFE 相比，Ag NWE 的循环伏安曲线具有明显的氧化还原峰，表明其电流信号较强，进一步证明Ag NW 与CFE 之间形成了紧密的电连接，表明制备的Ag NWE 具有良好的导电性。

图4 Ag NWE的扫描电镜图像及其在含有1 mmol/L K3Fe（CN）6的1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图Fig.4 SEM image of Ag NWE and its cyclic voltammetry in 1 mol/L KCl solution containing 1 mmol/L K3Fe（CN）6

此外，为了将制备的Ag NWE 应用于细胞内检测，其应具有良好的机械性能，以减少操作中的损毁。如图5 所示，制备的Ag NWE 在插入单个PC12 细胞时，Ag NW 并没有出现折断或弯曲的现象，而细胞在电极插入过程中发生轻微变形，并且可以从培养皿底部被电极抬起，直观地证明了所制备电极的机械性能优异，可以满足在细胞内检测的操作中对电极机械性能的要求。

图5 Ag NWE在插入单个PC12细胞过程中不同阶段的明场图像（比例尺为50 μm）Fig.5 Brightfield images of Ag NWE at different stages during insertion into single PC12 cell（Scale = 50 μm）

3 结论

本研究首先通过改变PVP与AgNO3之间的摩尔比、金属盐的种类，合成了长度为30 μm 左右、直径约为200 nm 的Ag NWs，然后采用靠取法成功制备了以CFE为基底的Ag NWE。电极经过一系列表征后，结果证明，其具有合适的尺寸、优异的导电性和良好的机械稳定性，可以满足在细胞内检测的实际需求。后续将寻找合适的活性材料和电极修饰方式，以构建高性能的单细胞纳米工具。