不同C18 固相萃取柱对鹌鹑蛋中6 类兽药残留测定的影响研究

2024-03-05王海玲霍思宇余洋王一名张凡陈冬东彭涛

质量安全与检验检测 2024年1期

王海玲霍思宇余洋王一名张凡陈冬东彭涛*

（1.中国检验检疫科学研究院北京 100176；2.检科院（北京）科学技术有限公司；3.中检科（北京）测试认证有限公司）

0 引言

我国是世界上鹌鹑蛋用量最大的国家之一，也是世界鹌鹑养殖大国。根据国家市场监督管理总局政务服务平台数据，自2014 年以来，共抽检鹌鹑蛋产品5 248 次，其中不合格次数为167 次，绝大多数以兽药残留超标为主，残留药物包括酰胺类、喹诺酮类、磺胺类、激素类、抗虫药类等[1-7]。

动物源性食品中多兽药残留的检测主要包括样品前处理和检测分析两大部分[8]。由于动物源性食品成分复杂、基质影响较大，以及其中所含的兽药残留相对较低，故对于动物源性食品中多种兽药残留很难进行分离与纯化[9]。因此，样品的前处理是兽药残留检测的关键环节，直接影响兽药残留化合物分析结果的准确性[10]。禽蛋类兽药残留常用固相萃取柱净化，最常用的为C18固相萃取柱，市场上生产C18固相萃取柱的厂家众多，技术水平差异也较大，如何能够有效评估不同厂家C18固相萃取柱对鹌鹑蛋中常检兽药之间净化的差异，是摆在研究者面前的难题。

本研究通过测定鹌鹑蛋中大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、激素类、抗虫药类6 类代表性兽药残留，研究不同C18固相萃取柱对鹌鹑蛋中6类兽药残留测定的影响。

1 试验方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂

鹌鹑蛋（北京农贸市场）。

标准物质：恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶、林可霉素、地塞米松、抗蚜威、四环素（检科院（北京）科学技术有限公司）。

甲醇、乙腈、丙酮（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲酸（质谱纯，美国赛默飞公司）；氯化钠、无水硫酸镁（分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司）。

固相萃取柱（规格：500 mg/6 mL，分别采购自6个厂家，分为A 柱、B 柱、C 柱、D 柱、E 柱、F 柱）。

1.1.2 仪器

GM300J 型刀式均质器（美国通用公司）；LC20AD-8045MS/MS 型液相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）；NBL 223i 型分析天平（英国艾德姆公司）；MS205DU型分析天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q Integral 5型超纯水（德国Merck 公司）；RQ-7000V 型超声仪（昆山超声仪器公司）；IKA MS3 型漩涡混合器（德国IKA 公司）；LG-25M 型高速离心机（四川蜀科公司）；移液器（5 mL、1 mL、200 μL，德国Eppendorf 公司）；滤膜（0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 试验过程

1.2.1 试样制备将采购的鹌鹑蛋去壳后于顶置均质器中均质混匀，将蛋液灌装于PET 瓶中，密封后于-18℃保存。

1.2.2 样品的提取

称取5 g 试样于50 mL 离心管中，加入20 mL 0.5%甲酸甲醇提取液，涡旋振荡2 min，再加入提取盐包（4 g Na2SO4，1 g NaCl），涡旋振荡2 min，8 000 r/min离心5 min 后，取上清液10 mL 置于鸡心瓶中，于128 psi、40℃的条件下，旋转蒸发至近干，加入1 mL甲醇溶液充分溶解。

1.2.3 净化

C18固相萃取柱需要活化，分2 次加入5 mL 甲醇活化，上样前保持柱子湿润；加入浓缩后的提取液，分次加入10 mL 甲醇洗脱；收集所有液体于鸡心瓶中，于128 psi、40℃的条件下，旋转蒸发至近干；加入1 mL 甲醇/水（1∶1 v/v）溶液充分溶解，经0.22 μm有机相滤膜过滤后，用HPLC-MS/MS 分析。

1.2.4 仪器设定条件

色谱条件：ZORBAX SB-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，粒径1.8 μm）；柱温：40℃；流动相：A 相为0.1%甲酸水溶液；B 相为甲醇；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL。洗脱梯度：0 min，0.1%甲酸水溶液=97.0%；3 min，0.1%甲酸水溶液=0.0%；4.5 min，0.1%甲酸水溶液=0.0%；6 min，0.1%甲酸水溶液=97.0%。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；多反应监测（MRM）；正离子模式；电喷雾电压：4 500 V；离子源温度：300℃；雾化气：3 L/min；辅助加热气：10 L/min。

1.3 评价方法

1.3.1 净化效果

取空白溶剂和过不同萃取柱的空白基质溶液，添加标准溶液，分别配制被测化合物系列基质匹配校准溶液和溶剂校准溶液，浓度范围：5～200 μg/L，按照“1.2.4”条件进行测定，得到目标物质离子色谱图，通过目视法比较不同样液的色谱图的差异情况，比较各色谱柱的净化效果。同时以检出峰面积作为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X，μg/L）得到标准曲线。通过基质标准曲线与相应溶剂校准标准曲线斜率的比值，评估基质效应。

1.3.2 回收率和精密度

采用不同C18固相萃取柱，对鹌鹑蛋中6 类兽药残留进行测定，比较低、中、高（5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg）3 个浓度水平固相萃取柱的加标回收的平均回收率、精密度，评价其检测效果。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

本研究分别比较了不同色谱柱对于这6 类兽药的分离效果，选择使用ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，粒径1.8 μm）；柱温：40℃。流动相中加入适量甲酸有利于化合物离子化，因此本实验采用0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%6 种不同含量的甲酸水作为流动相对标准溶液进行测定，对比目标物质的信号响应强度、峰型。

测定结果表明，甲酸浓度过低会降低目标物质信号强度，浓度过高会影响峰型，易出现拖尾峰，最终选用0.1%甲酸水作为流动相无机流动相。采用甲醇、乙腈作为有机相对比发现，甲醇作为流动相时，色谱响应优于乙腈，故本实验选取甲醇作为有机相。对比0.1%甲酸-乙腈（2+8、7+3）等度洗脱和不同比例的梯度洗脱程序后发现，梯度洗脱程序优于等度洗脱，能使目标物与干扰物质有效分离，优化后的梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

使用标准溶液进样，ESI 正负离子扫描，优化离子对，由低到高依次设定碰撞能量（CE），选取响应最高值作为CE，并通过Q3 Prerod 偏差优化选取最优产物离子，从中选取响应较高的作为定量离子。扫描结果显示，目标化合物在正离子监测模式时可形成丰度较高的[M+H]+，故采用正离子扫描模式。优化后的质谱条件见表2。

表2 保留时间和优化质谱参数Table 2 Retention time and optimized mass spectro metryconditions

2.2 提取条件的设计

本研究查阅了大量文献，分析其中对于蛋液中兽药残留的提取方式，分别比较了不同的提取液和提取方法，通过添加回收的方式比较回收率，确定合适的前处理过程。提取液选择甲醇、乙腈、0.5%甲酸甲醇、0.5%甲酸乙腈4 种，结果见表3。

表3 不同提取液对6 类兽药的回收率的影响Table 3 Matrix effect of six veterinary drugs

提取方法选择涡旋振荡、超声提取、涡旋振荡+超声提取3 种方案。结果显示，涡旋振荡提取6 类兽药的回收率85.3%～97.3%，超声提取的回收率61.3%～79.8%，涡旋振荡+超声提取的回收率81.9%～98.6%。表明超声提取方式的效果相对较差，涡旋振荡结合超声与单独涡旋振荡相比并无明显提升。最终确定0.5%甲酸甲醇作为提取液，涡旋振荡作为提取方法。

2.3 净化条件的设计

禽蛋样品中主要存在的干扰杂物质为脂质、色素等，本研究使用C18吸附样液中的杂质，选择使用通过性的方式净化，尽可能保证非极性物质被固相萃取柱吸附。具体操作过程参考国家标准及相关文献，通过5 mL 甲醇活化固相萃取柱，打开C18中的功能基团，同时保障固相萃取柱保持湿润，从而保证加入样液之后的净化效果。本研究在加入样液后使用10 mL 甲醇进行洗脱，一方面保证目标物质全部通过固相萃取柱，另一方面减少干扰物质流出。

2.4 净化效果

2.4.1 离子流图

对比图1 和图2 可知，目标物质分离度好，目标物质保留时间出峰一致，干扰物质响应不明显，对目标物质分析无影响。对比不同固相萃取柱净化效果，目标物质峰形良好，净化效果基本一致。

图1 溶剂加标的离子色谱图Fig.1 Ion chromatogram of labeled pure solution

图2 基质空白加标的离子色谱图Fig.2 Ion chromatogram of matrix labeled solution

2.4.2 基质效应

按实验方法对样品进行处理，在空白基质溶液中添加6 类兽药的标准溶液，浓度范围：5～200 μg/L，以检出峰面积作为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X，μg/L）得到基质标准曲线。分别计算与相应溶剂校准曲线斜率的比值，得到6 类兽药的基质效应，详见表4。

表4 6 类兽药的基质效应Table 4 Matrix effect of six veterinary drugs

结果如表4 所示，对于使用不同C18固相萃取柱的净化效果，同一种化合物不同净化样液的基质效应标准偏差均小于10%；磺胺间二甲氧嘧啶、林可霉素、地塞米松、抗蚜威表现为基质抑制，四环素等物质表现基质增强。

2.5 回收率和精密度

按实验方法对样品进行处理，分别添加混合标准溶液工作液，每一组样品做6 次平行，带入标准曲线中测定回收结果，计算平均回收率。

结果如表5 所示，5 μg/kg 浓度水平下，A 柱加标回收的平均回收率为95%～119.1%，精密度为2.6%～13.7%；B 柱加标回收的平均回收率为93.6%～103%，精密度为4.1%～8%；C 柱加标回收的平均回收率为78.8%～112.2%，精密度为3.9%～14.6%；D 柱加标回收的平均回收率为71.4%～105.6%，精密度为3%～10.3%；E 柱加标回收的平均回收率为82%～116.1%，精密度为5.4%～15.5%；F 柱加标回收的平均回收率为77.6%～104.1%，精密度为3.9%～10.3%。

表5 6 类化合物的加标回收率和相对标准偏差（n=7）Table 5 Recovery rates and relative standard deviations of six veterinary drugs（n=7）

10 μg/kg 浓度水平下，A 柱加标回收的平均回收率为87.7%～104.8%，精密度为0.7%～8.2%；B 柱加标回收的平均回收率为87.9%～103.9%，精密度为2.6%～8.3%；C 柱加标回收的平均回收率为84.7%～102.9%，精密度为2.3%～8.2%；D 柱加标回收的平均回收率为86.5%～105.3%，精密度为0.8%～8.5%；E柱加标回收的平均回收率为83.8%～106.3%，精密度为3%～7.9%；F 柱加标回收的平均回收率为86.6%～107.7%，精密度为0.8%～5%。

50 μg/kg 浓度水平下，A 柱加标回收的平均回收率为83.5%～106.5%，精密度为1.1%～5.9%；B 柱加标回收的平均回收率为87.3%～104.9%，精密度为2.1%～6.9%；C 柱加标回收的平均回收率为88.5%～100.5%，精密度为3.6%～9.5%；D 柱加标回收的平均回收率为92.3%～101.2%，精密度为2.9%～7.8%；E柱加标回收的平均回收率为93.7%～108.6%，精密度为4.1%～7.5%；F 柱加标回收的平均回收率为92.6%～108.8%，精密度为1.2%～7%。