HPLC法测定广西不同产地八角茴香中4种有机酸的含量

欧 敏，潘 宇，陈 路，赵成坚，侯小利，谭栀恩，张孟丽，李晓玲，吴芳芳*

（1.广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023；2.西南濒危药材资源开发国家工程实验室，广西 南宁 530023；3.右江民族医学院，广西 百色 533000）

八角茴香又称八角，为木兰科八角属植物Illicium verum Hook.f.的干燥成熟果实，其味辛、性温，适用于肾虚腰酸、胃寒呕吐等症，也常用作食用香料［1-2］。八角茴香含有挥发油、有机酸、黄酮、倍半萜内酯等多种化学成分，具有抑菌、抗炎、止痛、抗动脉粥样硬化等作用，是天然的抗病毒药［3］。莽草酸、原儿茶酸、对甲氧基苯甲酸、对羟基苯甲酸都是有机酸中的重要组成成分［4］。现代研究表明，莽草酸是合成抗H5N1 禽流感病毒药物“达菲”的重要成分，同时还具有减少软骨细胞自噬的损害等多种功效［5-6］；原儿茶酸临床可用于治疗慢性气管炎［7］；对甲氧基苯甲酸是合成茴拉西坦、酪氨酸酶抑制剂等药物的重要成分［8］；对羟基苯甲酸可以应用于化工、塑料、食品、医药及染料工业中［9］。广西是八角茴香的主要产地，八角茴香作用广泛，可用于医药工业、兽药工业及其他化学工业。通过挖掘八角的药效潜能，可有效发挥广西八角资源的实际价值，促进八角产业的发展。

目前，2020版《中华人民共和国药典（一部）》中八角茴香仅有对挥发性成分中挥发油和反式茴香脑的含量测定［10］，缺乏非挥发性成分的评价指标，质量控制仍不够完善。广西八角茴香产地较多，生长环境不同，药材品质之间存在一定的差异。本研究拟建立八角茴香中的莽草酸、原儿茶酸、对甲氧基苯甲酸、对羟基苯甲酸的含量测定方法，对广西11 个不同产地的八角茴香进行含量测定，以期为广西八角茴香的质量控制、品质优选及开发利用提供更多科学依据。

1 实验材料

1.1 试药与试剂 甲醇［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；乙腈［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；石油醚（天津市富宇精细化工有限公司）；莽草酸对照品（成都普菲德生物技术有限公司）；原儿茶酸对照品（四川省维克奇生物科技有限公司）；对羟基苯甲酸对照品（四川省维克奇生物科技有限公司）；对甲氧基苯甲酸对照品（四川省维克奇生物科技有限公司）；实验用水为屈臣氏蒸馏水；八角茴香药材分别采收于广西不同产地，由广西药用植物园蓝鸣生主任药师鉴定为木兰科八角属植物八角茴香Illiciun verum Hook.f.的干燥成熟果实。

1.2 仪器 LC-2030C-3D-Plus 型高效液相色谱仪（日本岛津仪器有限公司）；KQ-300VDE 型三频超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLERTOLEDO 型十万分之一电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；BSA124S 万分之一电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的配制 分别精密称取莽草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸5.060 mg、2.515 mg、3.006 mg、2.515 mg，置于5 ml 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得含量为莽草酸1.012 mg/ml、原儿茶酸0.503 mg/ml、对羟基苯甲酸0.501 mg/ml 和对甲氧基苯甲酸0.503 mg/ml的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取八角茴香粉末1 g，加水20 ml 超声波提取30 min，静置，称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 色谱柱：Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相：乙腈-3%磷酸水溶液，进行梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速：1.0 ml/min；进样量：10µl；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.4 系统适用性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10µl，按“2.3”项下色谱条件进行测定，色谱图见图1。结果莽草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸的色谱峰与相邻色谱峰分离度良好，其他成分对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图

2.5 标准曲线的绘制 精密吸取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件，以混合对照品进样量为横坐标（X），混合对照品峰面积的平均值为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程，见表2。

表2 线性关系考察结果

2.6 重复性试验 取供试品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算莽草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为2.4%、0.8%、1.8%、0.8%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 后按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算莽草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸峰面积的RSD 分别为0.9%、4.7%、3.1%、1.7%（n=8），结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样测定6次，计算莽草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸峰面积的RSD分别为0.4%、0.8%、0.9%、0.5%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取产自玉林大容山的八角茴香（含量为6.57%）的样品6份，每份约1 g，置锥形瓶中，精密加入“2.1”项下混合对照品溶液0.5 ml，按“2.2”项下方法制备加样回收样品溶液，然后按“2.3”项下色谱条件测定峰面积并计算回收率。结果莽草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸的加样平均回收率分别为102.5%、96.9%、101.6%、102.5%，RSD 值分别为1.5%、1.5%、1.1%、1.5%。表明加样回收率符合要求，结果见表3。

2.10 样品含量测定 取11 个产地八角茴香适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件进样测定，含量测定结果见表4。

3 讨 论

莽草酸是八角茴香的主要成分，其为水溶性成份［11］，因此采用水提取的方法能更好地提取分离出莽草酸。超声波提取效率高，提取时间也大为减少，因此采用超声波提取。

高效液相色谱法具有测量速度快、灵敏度高等优点，在药学分析检验中得以广泛应用［12］。本研究采用高效液相色谱法对八角茴香中4 种有机酸的含量进行检测，在预试验中，曾对色谱柱、柱温、不同波长及流动相进行考察。在色谱柱的选择中，本研究选择Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），其适用于分离非极性的化学物质。在柱温的选择中，分别考察了20 ℃、30 ℃、40 ℃，结果表明在40 ℃时柱压较稳定，分离效果最好。在波长的选择中，考察并比较了213 nm［13］和254 nm［14］的波长，结果表明在254 nm处莽草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸的吸收峰较213 nm处吸收峰大，且峰面积平稳，因此，选择254 nm作为测定波长。在流动相的选择上，本研究比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-3%磷酸水溶液等不同缓冲溶液，结果表明采用乙腈-3%磷酸水溶液作为流动相，通过梯度洗脱能得到较好的分离效果，且出峰时间较为理想。

本研究采用高效液相色谱法对八角茴香中莽草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸进行测定，方法操作简便，稳定性强，重复性好，可作为八角茴香的质量控制手段之一。