红甜菜根中萜类代谢物的比较代谢组学分析

李佳颖，刘乃新，韩广源

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2哈尔滨海关技术中心，哈尔滨 150023）

0 引言

红甜菜(BetavulgarisL.)别称为紫菜头，为苋科甜菜属的一种变种蔬菜，其球根可以作为蔬菜食用。追溯其原产地是在欧洲，引入国内后在江苏、吉林、山东、河南等省份广泛种植[1]。国内外研究证明，红甜菜根中除了含有人体所需的常规营养物质如碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质外[2-3]，还含有多种有益于人体健康的生理活性物质，如甜菜多糖、皂苷、甾醇、萜类、黄酮类及甜菜色素（包括甜菜红素和甜菜黄素））等。食用红甜菜根具有抗氧化[4-5]、降低血脂[6]、消炎和抑菌[7]、抗癌[8-9]、祛痰[10-11]、驱虫[12]、镇痛[13]等生物功效。

目前在植物中已经鉴定出萜类物质超过25000种，是一类以异戊二烯单元为基本骨架的天然烃类化合物，异戊二烯聚合物以及其所有的衍生物都隶属于萜类化合物[14-15]。根据萜类物质所含有的C原子个数，将萜类物质分为了半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜和多萜。具体的存在形式有醇、醛、羧酸、酮等。此外，植物细胞中会产生多种内源激素，有些激素的本质是萜类，如赤霉素是一类属于双萜类化合物的植物激素；脱落酸是一种具有倍半萜结构的植物激素[16]。萜类化合物中的信号物质和化感物质在植物防御系统中起到关键作用[17-18]。萜类物质与人类健康关系密切，也是人类日常膳食的不可或缺的营养素，例如富含三萜类化合物的化学成分具有抗高血糖作用[19]，而且多种倍半萜类化合物对铁死亡有抑制作用[20-21]。

为了比较不同品种红甜菜根中萜类代谢物差异，本研究选取两种东北地区主栽红甜菜品种作为试验材料，采用超高效液相色谱法-质谱联用技术，结合代谢组学检测技术，利用主成分分析法、聚类分析、正交偏最小二乘法等多种统计分析方法明确萜类差异代谢物，研究结果对开发利用红甜菜块根中萜类化合物，创制具有特殊萜类成分的红甜菜种质资源提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2个红甜菜品种‘一品红’和‘俄罗斯红’均由哈尔滨工业大学程大友教授团队提供。2022年4月在哈尔滨市农业科学院试验田播种，9月28日收获。2个品种的红甜菜根用于萜类成分检测。

1.2 试剂与仪器

试剂：甲醇、乙腈、甲酸，均为色谱纯，甲醇、乙腈品牌为Merck，甲酸品牌为Aladdin。仪器：研磨仪(MM 400)，德国Retsch 公司；超高效液相色谱(1290 UHPLC)，品牌Agilent；串联色谱(Applied Biosystems 6500 QTRAP)，美国AB Sciex 公司；色谱柱(SB-C181.8µm，2.1 mm×100 mm)，品牌Agilent。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集和预处理选取同一生长环境下红甜菜块根作为试验材料，每个品种选取6 株长势一致的甜菜根，处理备用。

斜45°取甜菜块根1 cm 直径的圆柱体，置于冻干机进行真空冷冻干燥处理，再移至研磨仪30 Hz 条件下研磨1.5 min，至粉末状；万分之一天平称取50 mg冻干粉末，将其溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每间隔30 min 涡旋一次，每次30 s，共进行6 次涡旋；然后将样品放置于离心机中，12 000 rpm 离心3 min，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤上清液，保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 µm)；流速1 mL/min；柱温40℃；进样量2 μL。流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈，梯度洗脱见表1。

表1 流动项梯度洗脱

1.3.3 质谱条件电喷雾离子源(ESI)温度500℃，离子喷雾电压(IS)5500 V（正离子模式）/-4500V（负离子模式），离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和气帘气(CUR)分别设置为50、60和25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。QQQ 扫描使用MRM 模式，并将气体（氮气）设置为中等。通过进一步去簇电压(DP)和碰撞能(CE)优化，完成了各个MRM 离子对的DP 和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，监测一组特定的MRM离子对，以获得检测峰图。

1.3.4 萜类化合物分析利用软件Analyst 进行数据采集，基于MWDB(metware database)数据库，根据混样质控样本(Quality Control，QC)的总离子流图及MRM代谢物检测多峰图，对样品的代谢物进行质谱定性分析。利用三重四极杆质谱的多反应监测模式完成萜类物质定量分析，分析方法为：计算一级质谱中的提取离子色谱峰的峰面积，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正，比较分析甜菜块根萜类化合物的含量。

1.4 数据分析

使用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 23.0(IBM Corporation，Armonk，NY，USA)及正交偏最小二乘法判别分析法(Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 样本质控

样品经HPLC-MS 分析，鉴定出的萜类化合物的保留时间、m/z、MS/MS 碎片离子等信息。结果显示代谢物检测总离子流的曲线重叠性高，即保留时间和峰强度均一致，表明质谱对同一样品不同时间检测时，信号稳定性较好。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。从总离子流图中可看出峰的纯度高，达到试验数据后期的分析要求。正/负离子模式下的总离子流图见图1、图2。

图1 混样样品质谱分析总离子（正离子）流图

图2 混样样品质谱分析总离子（负离子）流图

2.2 红甜菜块根中萜类物质分析

基于广泛靶向代谢组学技术对不同品种的红甜菜块根中的萜类成分进行了分析，研究结果表明样品中共含有48 种萜类化合物，其中二萜13 种，占比27.08%；三萜7种，占比14.58%；三萜皂苷7种，占比约14.58%；倍半萜7 种，占比约14.58%；倍半萜13 种，占比约27.08%；其他萜类1种，占比约2.08%。具体成分见表2。

表2 红甜菜块根中萜类成分

2.3 一品红及俄罗斯红甜菜中萜类差异代谢物分析

基于OPLS-DA 模型的结果，采取将fold change值、P-value 值、OPLS-DA 模型的VIP 值相结合的方法进行筛选，得出以下8个显著差异代谢物（图3）。在48个萜类成分中，有39种成分在两个品种间无显著性差异，“俄罗斯”红甜菜中有5种成分显著高于“一品红”，分别为桃叶珊瑚苷、苜蓿酸-3-O-葡萄糖醛酸苷-28-O-鼠李糖基(1,2)-阿拉伯糖苷、6′-O-芥子酰京尼平、筋骨草苷、原莪术醇，而6,9-二羟基-7-巨豆烯-3-酮等3种成分在“一品红”中含量较高，见表3。

图3 萜类差异代谢物火山图

表3 “一品红”和“俄罗斯”红甜菜萜类差异代谢物

3 讨论

苋科(Amaranthaceae)植物约有60 属850 种，广泛存在于自然界中。《中国植物志》收录苋科植物13属约40 种，其中7 属20 种植物含有三萜化合物[21]。甜菜属于苋科甜菜属作物。萜类化合物是植物中比较重要的化合物之一，已经发现很多化合物是中国药草的有效成分，同时它们也是一种重要的天然香料，是化妆品和食品工业不可缺少的重要原材料，其中一些萜类化合物还是重要的工业原料[22-23]。

现已研究发现，红甜菜中发现11种三萜皂苷类化合物，但是其他萜类成分未见报道。本研究通过比较不同红甜菜品种间根中萜类成分，确定在红甜菜根中除了含有三萜类化合物外，还含有单萜、二萜、倍半萜及其他萜类成分。本研究表明不同品种红甜菜根中萜类差异代谢物中，倍半萜化合物较多，其次还有三萜类化合物和单萜类化合物。倍半萜化合物的药理作用是基于倍半萜类成分显著的生物活性来实现的。通过查阅国内外文献，可发现倍半萜类成分具有神经保护，免疫调节，治疗糖尿病，抗肿瘤，改善急性脑缺血等作用[24]。如桃叶珊瑚苷，是植物的次生代谢产物，主要应用在医药行业、日用化工用品行业和饲料等行业。其具有清湿热、利小便、镇痛、降压、保肝护肝、抗肿瘤等作用。它还能促进干细胞再生,明显抑制乙型肝炎病毒DNA 的复制，其苷元及有效多聚体是一种抗菌素[25-26]。而红甜菜根中萜类成分的生物学功能还有待进一步研究。

4 结论

在“一品红”和“俄罗斯红”两个红甜菜根样品中筛选出的差异代谢物8种，其中下调物质5种，分别为桃叶珊瑚苷、苜蓿酸-3-O-葡萄糖醛酸苷-28-O-鼠李糖基(1,2)-阿拉伯糖苷、6′-O-芥子酰京尼平苷、筋骨草苷和原莪术醇；上调的物分别为Cis-guai-10-en-4α,11-diol、6′-O-葡萄糖桃叶珊瑚苷和6,9-二羟基-7-巨豆烯-3-酮。不同品种红甜菜中存在显著差异的萜类代谢物，可作为特征代谢物做进一步分析。