绒毛白蜡耐盐生理与解剖结构研究

燕丽萍，吴德军，王因花，高铖铖，任飞，刘翠兰

（山东省林业科学研究院/山东省林木遗传改良重点实验室，济南 250014）

0 引言

绒毛白蜡(Fraxinusvelutina)是木犀科(Oleaceae)白蜡属(FraxinusLinn.)的一种落叶乔木，抗逆能力强。研究证明，绒毛白蜡比刺槐、苦楝等林木的适应性更强[1-2]。因此，了解和研究绒毛白蜡这一树种，掌握它的耐盐功能及机制，具有重大意义。

已有一些学者开展了关于绒毛白蜡耐盐机理的相关研究。燕丽萍等[3]研究了盐胁迫下4 种白蜡植物的抗氧化酶的活性变化、叶绿素含量等相关生理指标并进行耐盐评价。王友平等[4]试验得出绒毛白蜡根、茎、叶中的盐离子分布情况影响其耐盐特性。刘海曼等[5]测定了NaCl 胁迫后绒毛白蜡的生物量、光合指标、渗透调节物质以及根、茎、叶中的钠钾离子含量等指标进行耐盐研究。同时，段丽君等[6]也对分根区盐胁迫下绒毛白蜡幼苗营养器官中的离子分配以及叶片中脯氨酸积累和可溶性糖含量进行了分析。武德等[7-8]初步研究和探明了盐碱胁迫下绒毛白蜡叶绿素含量及保护酶系统的变化规律。尽管许多文章对绒毛白蜡在盐胁迫下的反应进行了相关研究，但目前对于其品种间的耐盐研究基础资料较少，研究指标不够全面。本研究通过对绒毛白蜡4 个不同品种进行形态、生理等的研究与分析，并选择耐盐品种和盐敏感型品种进行根茎叶解剖结构观察，旨在为掌握绒毛白蜡的相关耐盐机制、筛选耐盐品种、推动中国盐碱地的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地及材料

试验地位于山东省济南市历城区山东省林业科学研究院苗圃基地，地理坐标为117°4′52″E，36°43′11″N，地处中纬度地带，属暖温带半湿润区的大陆性季风气候，年平均气温为14.3℃，年平均降水量为665.7 mm。选择苗木长势一致的二年生扦插苗‘金箭’(F.Velutina‘jinjian’)、‘华雄’(F.Velutina‘huaxiong’)、‘鲁蜡3 号’(F.Velutina‘lula3’)、‘盐蜡’(F.Velutina‘yanla’) 4 个绒毛白蜡品种进行盆栽盐处理实验，盆栽口径为35 cm，高为25 cm，盆栽置于苗圃塑料棚下进行培养。

1.2 试验方法

1.2.1 盐胁迫处理方法本试验于2020年6月31日开始。参照闫文华的研究结果[9]，绒毛白蜡不同品种在0.9%盐浓度时能较快出现耐盐症状差异。因此本试验选择用0.9%的NaCl 处理浓度浇灌植株，每盆4 L（试验前用水浇透以确定需要浇灌的盐溶液体积），以等体积清水为对照，盆底垫塑料托盘回收外渗液防止盐分损失。盆栽口径为35 cm，高为40 cm，置于苗圃塑料棚下进行培养，每个水平处理4株。在处理期间，保持其他条件不变，每7 d 定时浇灌4 L 9%的盐溶液。在0、14、28 d时分别对各品种的绒毛白蜡进行生理指标测定。每株取相同部位叶片适量，每个指标测定4次重复（每株一个重复）。

1.2.2 各指标的测定方法根据李合生等[10]的方法测定抗氧化酶活性、细胞膜透性、渗透调节物质等；Fv/Fm采用Hansatech 荧光仪在叶片暗处理30 min 后进行测定。每次盐处理之后用电导法测定土壤含盐量[11]，同时定时观察记录各植株叶片的颜色及胁迫症状。

1.2.3 解剖结构制片与观察方法盐处理28 d，每个品种每一植株在同一着生位置上选择根、茎、叶（取植株的第6～10片功能叶，将取得的叶片用切片沿主脉长度1/2 的位置切成几个长10 mm，宽5 mm 的小块；在根的成熟区切取约0.3 cm长的小段；在植株茎或侧枝的相同部位切取0.3 cm 的小段），用FAA 固定液（甲醛：冰醋酸：70%乙醇=1:1:18）固定24 h 以上。参照王振猛的方法[12]，采用常规石蜡制片法，番红-固绿双重染色，中性树胶制成永久切片。每一个处理每一植株制5张切片（切片厚度8～10µm），在光学显微镜下进行观察拍照，同时用二维测量软件对视野中各指标进行测量。每个处理随机选择20个视野进行观测，记录观测值，单位为µm。

1.2.4 耐盐性综合评价方法利用EXCEL和SPSS 21.0对实验数据进行统计与相关方差分析，同时采用隶属函数综合分析法对绒毛白蜡4个品种进行耐盐性强弱排序，得出结果。

2 生理实验结果与分析

2.1 盐处理下绒毛白蜡形态特征及表型增长量的变化

盐处理14 d 时，4 个品种的株高增长量和地径增长量无明显差异，而在处理28 d时，‘盐蜡’的株高增长量最高且显著高于‘金箭’和‘华雄’，与‘鲁蜡3 号’无显著差异。处理28 d 时，4 个品种的地径增长量相互之间有显著差异，其中‘盐蜡’的地径增长量最高，而‘华雄’的地径增长量最低，说明其受到的胁迫影响较大(P＜0.05)（图1）。

图1 盐胁迫下各品种的株高增长量及地径增长量

随着盐胁迫时间的不断增加，4 个不同品种的形态特征出现不同的变化（表1）。盐处理14 d之前各品种生长形态正常，当盐处理21 d时，‘华雄’的少数叶片叶尖开始出现干枯变黄，其余品种无异常；盐处理28 d时，‘华雄’的发黄叶片增多，且少量逐渐脱落，其余3个品种的叶片都开始变黄，‘鲁蜡3 号’和‘盐蜡’变黄叶片很少；而在处理34 d时，‘华雄’的大多数叶片开始变黄脱落，‘金箭’也有部分叶片脱落变黄，‘鲁蜡3号’和‘盐蜡’的少数底部叶片变黄。可以看出，‘华雄’最先出现盐害症状，且症状最为严重，而‘鲁蜡3 号’和‘盐蜡’比较耐盐。

表1 不同盐胁迫时间下绒毛白蜡的形态特征变化

2.2 盐处理下绒毛白蜡质膜透性的变化

盐处理14 d，4个品种的相对电导率无明显差异，盐处理28 d时，‘华雄’的相对电导率比处理前增加了134.4%，‘金箭’、‘鲁蜡3 号’和‘盐蜡’分别增加了48.5%、55.9%、54.0%，‘鲁蜡3 号’的相对电导率最低，且显著低于‘盐蜡’，‘华雄’受到影响最大（图2）。

图2 盐胁迫下各品种的相对电导率

2.3 盐胁迫下绒毛白蜡及叶绿素荧光参数的变化

盐害影响叶绿体的结构及植物的光合作用。处理28 d，4个品种的Fv/Fm都低于对照，‘鲁蜡3号’和‘金箭’的Fv/Fm明显高于‘盐蜡’，且和对照相比降低较少，说明‘鲁蜡3 号’和‘金箭’的光合结构未受到严重损伤(P＜0.05)（图3）。

图3 盐胁迫下绒毛白蜡各品种的Fv/Fm参数

2.4 盐处理下绒毛白蜡可溶性蛋白含量的变化

盐处理条件下，植物对逆境胁迫的反应也可以通过可溶性蛋白含量的变化来判断。如图5 所示，处理14 d 时，‘鲁蜡3 号’的可溶性蛋白含量上升最快且数值达到最大，‘盐蜡’的含量仅次于‘鲁蜡3 号’，而‘华雄’的可溶性蛋白含量最低；处理28 d时，‘盐蜡’的可溶性蛋白含量达到最大，其次是‘鲁蜡3号’，‘金箭’的可溶性蛋白含量数值最小，‘华雄’的含量随盐胁迫增加变化不大（图4）。

图4 盐胁迫下绒毛白蜡各品种的可溶性蛋白含量

图5 盐胁迫下绒毛白蜡各品种的抗氧化酶活性

2.5 盐处理下绒毛白蜡抗氧化酶活性的变化

随着盐处理时间的延长，‘华雄’的SOD活性一直升高，且增长波动幅度较大，说明‘华雄’遭受胁迫较严重，而其他3个品种在盐处理14 d后开始逐步升高，盐处理28 d 时‘金箭’、‘华雄’、‘盐蜡’的SOD 酶活性相差不大。随着盐胁迫浓度的增加，‘盐蜡’的CAT活性一直处于较高水平，且呈直线上升的趋势，盐处理14 d时，‘华雄’和‘金箭’CAT 活性较低；处理28 d 时，‘华雄’和‘鲁蜡3号’的CAT活性处于较低水平（图5）。

2.6 盆栽土壤含盐量的测定

对每一处理的每个盆栽持续浇灌9‰的盐水后进行土壤含盐量的测定。由表2可知，处理前，盆栽的土壤含盐量保持在0.52‰～0.69‰之间；处理14 d 时，土壤含盐量在3.38‰～4.17‰之间；处理28 d 时，土壤含盐量在4.19‰～4.77‰之间。4个品种的盆栽土壤含盐量相差不大。

表2 盐胁迫下土壤含盐量的测定

2.7 绒毛白蜡4个不同品种耐盐强弱的综合评价

表3 可知，盐处理28 d绒毛白蜡各品种的13 个指标用综合隶属函数法分析所得结果。各指标都赋予100%的权重，最终根据隶属函数平均值得出的各品种耐盐性强弱排序为：‘盐蜡’＞‘鲁蜡3号’＞‘金箭’＞‘华雄’，可知‘盐蜡’的耐盐性最强，其次是‘鲁蜡3 号’，‘金箭’的耐盐性排在第三，而‘华雄’最不耐盐。

表3 绒毛白蜡4个品种的隶属函数分析

3 显微结构观察结果

通过生理实验各项生理指标综合分析得出结果可选出耐盐性品种‘盐蜡’和盐敏感型品种‘华雄’继续进行试验，即分别对‘盐蜡’和‘华雄’2 个品种进行根茎叶解剖结构的观察。

3.1 叶解剖结构观察

绒毛白蜡叶片为异面叶，上下表皮各由一层细胞组成，表皮上存在角质层，叶肉由栅栏组织和海绵组织组成，栅栏组织由2～3 列细胞紧密排列，为长柱形，海绵组织则排列较为疏松（图6）。表4 经过方差分析得出(P＜0.05)，‘盐蜡’处理的叶平均厚度最大，且显著高于‘华雄’，‘华雄’处理的叶平均厚度显著高于对照，‘华雄’‘盐蜡’盐处理之后的叶平均厚度比对照分别增加了21.18%和6.19%，‘盐蜡’处理比‘华雄’处理大13.15%；‘华雄’对照的上表皮厚度显著高于处理的厚度，‘华雄’处理的下表皮厚度显著高于‘盐蜡’处理，‘盐蜡’对照与处理之间的上下表皮厚度无显著差别；‘盐蜡’处理的栅栏组织厚度显著高于其对照，增加了22.11%，‘华雄’处理的栅栏组织和海绵组织厚度均显著高于其对照，分别比对照高出47.35%和17.23%，‘盐蜡’处理的栅栏组织厚度比‘华雄’处理高出19.46%；2个品种栅栏组织与海绵组织厚度之比盐处理后都高于对照；‘华雄’处理的角质层厚度显著高于对照，而‘盐蜡’处理前后的角质层厚度无显著差异。可以看出，耐盐性较强的‘盐蜡’其叶平均厚度、栅栏组织厚度和栅海比均高于‘华雄’，且经过盐处理之后厚度变大。

表4 绒毛白蜡叶横切面解剖结构参数

图6 绒毛白蜡各处理叶片解剖结构

绒毛白蜡叶片中脉发达，包括木质部、韧皮部、形成层等结构，其中木质部面积较大，为植物的水分运输发挥着重要作用（图6）。叶片主脉解剖结构参数的方差分析结果可知（表5），由(P＜0.05)，‘华雄’对照的叶片中脉直径显著小于‘华雄’处理，‘盐蜡’处理的中脉直径与对照之间无显著差异；‘盐蜡’处理的木质部厚度显著高于‘盐蜡’对照，而两者的韧皮部厚度无显著差异，‘华雄’处理的木质部厚度和韧皮部厚度均显著高于‘华雄’对照，盐处理之后的‘华雄’和‘盐蜡’的木质部厚度分别比对照增加了13.58%和15.61%，且‘盐蜡’比‘华雄’的木质部厚度高出8.38%；2 个品种的木质部与韧皮部厚度之比在1.37～1.59之间，而‘盐蜡’处理的木质部厚度与韧皮部厚度之比显著高于‘盐蜡’对照，且显著高于‘华雄’处理和对照，‘华雄’处理和对照之间无显著差异。经过盐处理之后，绒毛白蜡2 个品种的木质部厚度明显增大，且耐盐性较强的‘盐蜡’厚度高于耐盐性较弱的‘华雄’，同时，盐处理后的‘华雄’中脉直径、韧皮部厚度均显著增加。

表5 绒毛白蜡叶片主脉解剖结构参数

3.2 茎解剖结构观察

茎是连接植物地上部分与地下部分的关键器官，图7可以看出，二年生绒毛白蜡的茎横切面为圆形，主要包括表皮、皮层、韧皮部、形成层、木质部、髓部等，其中的木质部和韧皮部均由多层细胞构成，呈环形分布，木质部面积较大，导管数量较多、大小不一，且分布范围较广，韧皮部在木质部外围，中心的髓部呈近圆形或椭圆形，较发达，髓细胞中含有少量淀粉粒。盐处理前后茎的解剖结构发生显著变化。由表6结果可知，‘盐蜡’的皮层厚度显著高于‘华雄’，处理之后的‘盐蜡’皮层厚度显著高于对照，而‘华雄’处理与对照之间无显著差异；‘华雄’在处理前后韧皮部厚度无显著变化，而‘盐蜡’在处理之后韧皮部厚度显著降低；2 个品种的木质部厚度在处理前后均无显著差异，盐处理之后的‘盐蜡’木质部厚度显著高于‘华雄’；茎的木质部分布有数量较多的导管，导管孔径的大小对茎的运输起着重要作用，胁迫后的‘盐蜡’最大导管直径显著高于‘华雄，‘华雄’在胁迫前后最大导管直径无显著变化；处理之后2 个品种的髓直径都出现显著增大，‘华雄’处理比对照增加了72.23%，‘盐蜡’处理比对照增加了38.73%，同时‘盐蜡’对照的髓直径显著高于‘华雄’对照。

表6 绒毛白蜡各处理茎显微结构参数

图7 绒毛白蜡各处理茎横切面解剖结构

3.3 根解剖结构观察

植物的根能够较强地吸收营养物质，与其生理生态紧密相关。图8 可以看出，二年生绒毛白蜡的根包括周皮、皮层、韧皮部、形成层、木质部等。周皮包括木栓层2～3 层，根的导管数量较多，孔径大小各不相同。根横切面中占据面积最大的是木质部，其呈辐射状分布，中心无髓。由根的解剖结构参数测定结果可知（表7），‘华雄’和‘盐蜡’在处理前后根直径均无显著差异；2 个品种盐处理之后的周皮厚度与对照相比显著增加，其中‘华雄’比对照增加了31.43%，而‘盐蜡’增加了13.90%，2 个品种之间的周皮厚度无显著差异；‘盐蜡’处理前后的皮层厚度无显著变化，而处理后的‘华雄’皮层厚度显著增加，‘华雄’处理的皮层厚度显著高于‘盐蜡’处理；2 个品种盐处理前后的中柱直径无显著差异，‘盐蜡’的中柱直径高于‘华雄’；‘华雄’和‘盐蜡’的最大导管直径处理前后无显著差异，2个品种之间也无差别；2个品种的中柱直径/根直径在0.75～0.85之间，处理之后‘华雄’的中柱直径/根直径比值显著降低，而‘盐蜡’无显著变化；‘华雄’和‘盐蜡’的周皮厚度/皮层厚度比值处理前后无显著差异，但‘华雄’的周皮厚度/皮层厚度比值高于‘盐蜡’。可以看出，绒毛白蜡根的解剖结构在品种之间有差异，盐胁迫前后也会出现一定的变化。

表7 绒毛白蜡各处理根显微结构参数

图8 绒毛白蜡各处理根横切面解剖结构

4 结论与讨论

由生理试验隶属函数综合分析得出其耐盐性强弱排序为：‘盐蜡’＞‘鲁蜡3号’＞‘金箭’＞‘华雄’，其中‘盐蜡’最耐盐，而‘华雄’耐盐性最弱，且最早出现明显叶片胁迫症状的也是‘华雄’，有力地证明了该品种较弱的耐受性。盐处理14 d 时，4 个品种的绒毛白蜡可溶性蛋白含量上升，可能是Na+进入细胞后激活了DNA的活性或促进了特异蛋白的产生[13]；盐处理28 d时‘盐蜡’的可溶性蛋白含量最高，调节能力强。冯建灿等[14]通过试验得出，盐处理下植物光合结构遭到破坏，一般会出现Fv/Fo、Fv/Fm等的下降。与处理前相比，盐胁迫下4个品种的绒毛白蜡Fv/Fm均下降，而‘鲁蜡3号’的Fv/Fm值达到最高，表明耐盐性较强的品种光合机构不易遭到明显破坏。细胞中抗氧化酶活性的增强便是植物抵抗逆境胁迫的一种反应，低盐胁迫时酶活性随胁迫程度的增强而上升，当达到植物所不能承受的盐害程度，酶活性将随之下降[15]。上述实验中，盐处理条件下绒毛白蜡各品种的SOD 酶和CAT 酶活性基本都上升，处理过程中，‘华雄’的SOD 活性变化较大，CAT 酶活性都较低，而‘鲁蜡3 号’和‘盐蜡’的CAT 酶活性都较高。盐处理28 d，‘鲁蜡3 号’的相对电导率最低，说明其耐盐能力强。实验过程中出现了质膜透性数值的下降，可能与植物体内一些应急蛋白的调节作用有关[16]。这些生理指标的研究和测定从不同方面表明了绒毛白蜡不同品种对盐胁迫的反应，为之后的研究奠定了基础。

由显微结构观察实验结果可知，盐处理之后‘华雄’和‘盐蜡’的叶片厚度和栅栏组织厚度均增大，这与姜伟等[17]对辣椒叶片解剖结构的研究结果一致。盐处理后‘盐蜡’栅栏组织厚度和叶片厚度均显著高于‘华雄’及对照，董占元等[18]发现栅栏组织具有一定的泌盐作用。2个品种的栅栏组织/海绵组织厚度比值都显著增加，栅海比也是植物应对胁迫的一种方式。盐处理后2 个品种的角质层厚度提高，而‘华雄’提高显著。研究发现，白蜡叶片的角质层具有一定的保水作用，可在一定程度上阻止细胞水分的蒸发[12]。因此，角质层变厚对绒毛白蜡耐盐具有一定的意义。‘华雄’的海绵组织厚度在盐处理前后有显著差异，但其数值均小于‘盐蜡’。海绵组织靠近叶片的下表皮，处于背光位置，在植物遭受盐胁迫时受到的影响可能相对较小。胁迫后各品种的木质部厚度增加，且‘盐蜡’显著高于‘华雄’，‘盐蜡’木质部厚度/韧皮部厚度的比值显著高于‘华雄’。叶厚度、栅栏组织厚度等主要指标可作为评判各品种耐盐性差别的重要依据[19]。

‘华雄’和‘盐蜡’2个品种盐处理之后的根的周皮厚度与对照相比均出现显著增加，同时‘华雄’与‘盐蜡’相比增加的更多，周皮厚度的增加能够有效提高植物抵抗外界胁迫的能力，处理后的‘华雄’皮层厚度显著增加，且显著高于‘盐蜡’，‘盐蜡’的皮层厚度较小，有利于植物更快地向中柱输送营养物质及水分，‘华雄’的周皮和皮层厚度在盐处理之后均显著增加，是其应对胁迫的一种反应，这与前人研究结果一致[20]。‘盐蜡’的中柱直径高于‘华雄’，根的中柱直径大反映了植物根吸收营养物质的能力强，处理之后‘华雄’的中柱直径/根直径比值显著降低，说明其抵抗盐胁迫的能力较差，而耐盐性较强的盐蜡的中柱直径/根直径比值无显著变化。

‘盐蜡’在处理之后茎的韧皮部厚度显著降低，可为木质部的运输提供有利条件。而‘华雄’的韧皮部厚度处理前后无显著变化。混盐胁迫下辣椒茎木质部的面积增大[17]，盐处理之后的‘盐蜡’木质部厚度显著高于‘华雄’。盐胁迫后的‘盐蜡’最大导管直径显著高于‘华雄’，最大导管直径的增大有利于水分在茎内的运输和保持，因此‘盐蜡’抵抗渗透胁迫的能力增强，这与前人研究结果一致[21]。处理之后2个品种的髓直径都出现显著增大，髓面积也相应地增加，这与朱宇旌等的研究结果一致[22]。同时‘华雄’处理比‘盐蜡’处理增加的更多，‘盐蜡’对照的髓直径显著高于‘华雄’对照，有利于茎运输能力的提高。

从形态、生理和解剖结构等角度可以看出，绒毛白蜡对盐害环境有较强的适应能力。不同植物对待相同或不同生境的适应方式不同，在适者生存的自然法则下，植物演化出了特殊的结构如盐腺等来提高其生存能力，而这些解剖结构就是我们用来判断植物抗性功能的重要方面。盐害使植物的生理、结构和功能受到损伤，烯效唑等生长调节剂能通过改变植物内部组织及膜结构使其受到的伤害得到缓解，这可能是未来研究植物解剖结构的另一个具有一定价值的方向。植物根茎叶的取材部位不同得到的变化结果也会不同，因此，可以通过不同角度的研究得到相对准确的结果。植物耐盐的过程与途径受到多种因素的影响，在试验过程中应当全面考虑周围环境条件、盐胁迫周期、胁迫类型、植物生长阶段等各种因素的影响，综合植物蛋白组学、转录组学等多种研究方式，为绒毛白蜡优良品种的选育作出努力。总而言之，绒毛白蜡耐盐机制的研究还有许多方面需要探索。