气相色谱-质谱法测定中棉所49 棉籽仁中的植物甾醇组成

方丹，杨瑞楠，徐双娇，田新权，马磊*

（1.中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物育种与综合利用全国重点实验室，河南安阳 455000；2.河南工业大学粮油食品学院，郑州 450000）

棉籽是棉花加工的副产品， 含油量为15%～25%，是最早用于制作食用油的植物油料之一。 棉籽中含有丰富的不饱和脂肪酸、氨基酸、维生素E、甾醇等成分。棉籽油曾是棉花主产区居民的主要食用油。 然而，棉籽中含有棉酚和少量的环丙烯脂肪酸，限制了棉籽油在食品工业中的应用[1]。 作为棉籽中的重要脂溶性营养成分，植物甾醇具有重要的营养价值。 由于人体不能合成植物甾醇，只能通过饮食摄取，因此，植物甾醇也是植物油中必需的一种营养成分。 植物甾醇不仅可以调节机体代谢[2]，抑制胆固醇的吸收，降低血脂[3-4]，还具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤、抗癌等生理功能[5-8]，是一种对人体非常有益的次生代谢产物。 此外，甾醇也是天然抗氧化剂，已被许多国家用于食品、保健品等领域，以满足人体对微量营养元素的需求，对改善人体健康具有积极的作用。 因此，甾醇的提取和应用是当前的研究热点。 目前，国内主要研究植物甾醇的提取和检测，原料主要是棉籽油加工过程中产生的脱臭馏出物， 从棉籽中直接提取植物甾醇的研究尚未见报道，且植物甾醇在工业中应用的报道也较少。

本研究采用气相色谱- 质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）对中棉所49[9]棉籽仁中的植物甾醇组成进行了分析，并对不同植物甾醇的含量进行了测定，旨在为鉴定棉籽产地来源提供方法参考，并为高甾醇棉籽和棉籽油的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为早中熟陆地棉品种中棉所49[9]，由中国农业科学院棉花研究所选育并提供。

所用标准品包括胆固醇（纯度≥99.0%）、菜油甾醇（纯度≥99.0%）、β- 谷甾醇（纯度≥95.0%）、豆甾醇（纯度≥95.0%）、5α- 胆甾烷-3β- 醇（纯度≥98.0%）， 均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。 其他试剂：氢氧化钾，由美国Sigma 公司生产；乙醇、正己烷（均为色谱纯）、N- 甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺［N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide,MSTFA］，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

包括：8890-7000D 气相色谱-三重四级杆质谱联用仪（美国安捷伦科技公司）；XS105DU 电子天平［梅特勒托利多（上海）有限公司］；5417R 小型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；VORTEX 2 S025 涡旋混匀器（德国IKA 公司）；干浴器（德国IKA 公司）；水浴氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 样品前处理

为检测中棉所49 光籽的植物甾醇含量， 根据参考文献[10-11]，优化测定方法如下：首先准确称取200 mg 棉籽仁样品磨碎后加入10 mL 聚四氟乙烯管中， 再加入100 μg·mL-1的5α- 胆甾烷-3β-醇内标溶液200 μL 和2 mol·L-1的氢氧化钾乙醇溶液（所用体积分数为90%的乙醇由90 mL 乙醇与10 mL 去离子水配制）2 mL，涡旋震荡1 min，再进行30 min 超声处理；将样品放入75 ℃干浴器进行皂化处理1 h；之后冷却至室温并加入1 mL 正己烷 和2 mL 超 纯 水 混 合 均 匀，5 000 r·min-1离 心10 min 后取上清液于10 mL 试管中， 再加入正己烷和超纯水共进行3 次提取，合并上清液后，置于水浴氮吹仪上氮吹至近干。 向残留的甾醇中加入100 μL 衍生剂MSTFA， 在80 ℃烘箱内衍生处理30 min， 最后用正己烷定容至500 μL 以备气相色谱-质谱分析。

1.4 气相色谱-质谱分析

同一样品取3 份，对植物甾醇进行提取、测定，并计算甾醇含量的平均值。

气相色谱：使用毛细管柱HP-5MS（色谱柱长度30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm），进样口温度为290 ℃，分流比为10∶1，进样量为1 μL，流速为1.0 mL·min-1，升温程序如下：初始温度为100 ℃，保持1 min， 之后以40 ℃·min-1的速率升至290 ℃，并保持15 min。

质谱检测：采用电子电离（electron ionization,EI）方式，电离电压为70 eV，离子源温度为250 ℃，传输线温度为280 ℃，扫描质量范围为35～550 u。通过将保留时间与标准品比对，最终确定各植物甾醇的结构和含量。

半定量分析方法：以5α-胆甾烷-3β-醇为内标物，以豆甾醇为标准品绘制标准曲线：y＝0.727 2x＋0.003 68［其中，峰面积与内标峰面积之比为x，标准品质量浓度（μg·mL-1）与内标物质量浓度（μg·mL-1）之比为y，R2＝0.999 0］，其他各种植物甾醇的含量（mg·hg-1）均根据豆甾醇的质量浓度、棉籽仁样品质量及样品溶液体积计算，总甾醇含量为各种甾醇含量之和。

2 结果与分析

2.1 棉籽仁中植物甾醇种类的鉴定

经过MSTFA 硅烷化后， 中棉所49 棉籽仁中的植物甾醇经气相色谱能够很好地分离，总离子流色谱图见图1。 通过标准品保留时间和GC-MS 中的离子碎片对主要甾醇进行定性分析[12-14]，解谱后可以鉴定出中棉所49 棉籽仁中含有9 种甾醇（表1）。

表1 中棉所49 棉籽仁中甾醇类化合物的组成及其含量

图1 中棉所49 棉籽仁中甾醇衍生物GC-MS 总离子流色谱图

中棉所49 棉籽仁中所含甾醇按照其出峰顺序依次是胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、β- 谷甾醇、Δ5-燕麦甾醇、 羽扇豆醇、Δ7- 燕麦甾醇、24- 亚甲基环木菠萝烷醇和高根二醇，它们经过硅烷化后的结构式和质谱图见图2。 通过对比标准品保留时间的方法确定总离子流色谱图（图1）中的各种组分，确定的甾醇种类有胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇和β- 谷甾醇。 另外，在保留时间为15.049 min、15.840 min、16.161 min、17.129 min 和18.052 min 的 未知组分中，通过与标准质谱谱库（National Institute of Standards and Technology 17,NIST 17）中的质谱图进行比对，发现检索结果的匹配度均大于70%，试验所得质谱图（图2）中特征离子峰以及谱峰的相对丰度与NIST 17 谱库中的质谱图具有良好的一致性，最终确定保留时间为15.049 min、15.840 min、16.161 min 和17.129 min 的未知组分依次是Δ5-燕麦甾醇、羽扇豆醇、Δ7-燕麦甾醇和24-亚甲基环木菠萝烷醇。保留时间为18.052 min 的组分可能是高根二醇或熊果醇，通过对比二者的质谱图中质荷比（m/z）为203 和216 的2 个质谱峰的相对丰度特征，最终确定该组分是高根二醇。

图2 中棉所49 棉籽仁中甾醇类化合物及内标5α-胆甾烷-3β-醇的质谱图

2.2 棉籽仁中植物甾醇含量

中棉所49 棉籽仁中含有9 种甾醇类化合物，每100 g 棉籽仁中甾醇总含量为124.870 mg。 其中：含量最高的是β- 谷甾醇，每100 g 棉籽仁中的含量为99.483 mg，占甾醇总含量的79.669%；其次是菜油甾醇，每100 g 棉籽仁中的含量为13.295 mg，占甾醇总含量的10.647%（表1）。 这2 种甾醇含量占甾醇总量的90.316%。 另外，Δ5-燕麦甾醇、高根二醇、羽扇豆醇和豆甾醇的含量分别占甾醇总量的4.238%、1.966%、1.808%和0.796%，合计占8.808%。虽然高根二醇的含量仅占甾醇总量的1.966%，但它是棉籽仁中的特征甾醇组分。 每100 g 棉籽仁中胆固醇的含量为0.324 mg，其含量占甾醇总含量的0.259%。

3 讨论与结论

植物甾醇主要存在于植物油、 坚果和种子中。不同植物中的甾醇含量各不相同， 如每100 g 大豆、油菜、花生、棉花和玉米种子中的总甾醇含量分别为3～450 mg、7～1 130 mg、2～290 mg、2.8～640.0 mg 和700～2 210 mg[15-16]，其甾醇组成特征也不同。因此，植物甾醇是区分油料及植物油种类、品质的一类重要化合物。

植物甾醇包括游离甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷、酰基甾醇糖苷等。 本研究通过皂化提取、有机溶剂萃取、硅烷化衍生、GC-MS 方法，测定了中棉所49 棉籽仁中总甾醇的组成及其含量。 结果显示，中棉所49 棉籽仁中含有9 种植物甾醇，每100 g 棉籽仁中总甾醇含量为124.870 mg，其中β- 谷甾醇、菜油甾醇、Δ5- 燕麦甾醇是主要成分， 分别占总甾醇含量的79.669%、10.647%和4.238%，β- 谷甾醇是棉籽中含量最丰富的甾醇；含量仅占总甾醇含量1.966%的高根二醇， 则是中棉所49 棉籽仁甾醇的特征成分。 普遍认为植物油中不含胆固醇，而本研究在中棉所49 棉籽仁中检测到少量胆固醇。 上述棉籽仁植物甾醇成分分析为研究棉籽及棉籽油的营养功效奠定了基础。此外，通过植物甾醇成分分析，可以鉴别不同种类的植物油或区分高低档油。但对于棉籽中游离甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷、酰基甾醇糖苷等的测定和植物甾醇生理活性的分析， 还有待进一步的探究。