高迁移率族蛋白1对低氧状态下肺动脉平滑肌细胞的影响研究

李鸣远，李倩，武云

作者单位：830054 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院全科医学科

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种由多因素所致的呼吸系统疾病，表现为进行性肺血管重塑、肺动脉压持续升高，随着病情持续进展，会引发右心室代偿性肥厚，最终导致右心衰竭［1］。以中小肺动脉壁增厚和管腔闭塞为特征的肺血管重塑是PAH患者肺血管阻力和肺动脉压升高的主要原因。肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMC）作为肺血管壁的主要成分，其异常增殖和迁移是肺血管重塑的主要特征，也是PAH发生和疾病进展的基础［2-3］。细胞焦亡是一种新型程序性细胞死亡形式，表现为细胞膜不断扩张，引起细胞肿胀、破裂，并释放大量促炎因子。在低氧环境下PASMC会发生细胞焦亡，这与PAH的发病机制密切相关［4］。

高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种染色质相关蛋白，在某些应激条件下，其从巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞或其他免疫活性细胞中释放，并通过与受体结合来促进细胞增殖、迁移和分化［5］。HMGB1现已被确定为PAH的生物标志物，在PAH患者的肺组织和血清中HMGB1水平异常升高，并且与疾病严重程度呈正相关［6］。HMGB1靶向治疗可能成为PAH的有效治疗策略。然而，HMGB1如何驱动PAH发病的分子机制仍有待阐明。基于此，本研究以PASMC为研究对象，观察HMGB1对低氧状态下PASMC增殖和迁移的影响，并进一步探讨HMGB1中和抗体（HMGB1 Ab）治疗PAH的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

本实验时间为2022年3月—2023年9月。PASMC购于武汉云克隆科技股份有限公司，HMGB1 Ab购于沈阳万类生物科技有限公司，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体激动剂——单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）购于美国InvivoGen公司，胎牛血清、牛血清白蛋白、DMEM培养基及胰酶购于美国Hyclone公司，CCK-8细胞增殖检测试剂盒购于上海贝博生物科技有限公司，Triton X-100购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料购于北京康瑞纳生物科技有限公司，TRIzol RNA提取试剂盒购于美国Invitrogen公司，cDNA第一链合成试剂盒和探针法荧光定量PCR检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，Bradford蛋白质定量试剂盒购于北京百奥莱博科技有限公司，封闭用脱脂奶粉购于北京伊塔生物科技有限公司，RIPA裂解液和ECL试剂液购于上海碧云天生物技术研究所，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购于美国Thermo Fisher公司，AlexaFluor 488荧光标记的山羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购于北京百奥莱博科技有限公司，α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、HMGB1、NLRP3、天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）、gasdermin D（GSDMD）、白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、白介素18（interleukin 18，IL-18）兔多克隆抗体以及GAPDH兔多克隆抗体购于英国Abcam公司。

1.2 PASMC培养、分组及处理

将PASMC置于含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养，常规传代，选用第3～5代细胞进行后续实验。将PASMC分为4组：（1）对照组：PASMC置于37 ℃、21% O2、5% CO2培养箱中常氧培养24 h；（2）低氧组：PASMC置于37 ℃、3% O2、5% CO2培养箱中低氧培养24 h；（3）HMGB1 Ab组：PASMC置于37 ℃、3% O2、5% CO2培养箱中低氧培养24 h，加入终浓度为20 μg/ml的HMGB1 Ab培养3 h；（4）HMGB1 Ab＋MSU组：PASMC置于37 ℃、3% O2、5% CO2培养箱中低氧培养24 h，加入终浓度为20 μg/ml的HMGB1 Ab培养3 h，然后采用终浓度为200 g/L的MSU活化细胞3 h。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖活力

将PASMC以5×103个/孔的密度种植在96孔板中，每组设置6个复孔，分组及处理同1.2。按照CCK-8细胞增殖检测试剂盒说明书，每孔加入10 μl CCK-8，继续培养4 h，采用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的OD值，代表细胞增殖活力。

1.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

胰酶消化各组PASMC，制备细胞悬液，按照5×105个/孔的密度将PASMC种植在划好标记线的6孔板中，生长24 h待细胞铺满后，使用10 μl无菌枪头在细胞的中央区域垂直划线，使划痕与标记线相交，PBS洗去划下的细胞。将细胞放入37 ℃、5% CO2条件下培养。24 h后取出细胞培养板，在显微镜下观察划痕并拍照，以0 h作为对照，采用Image Pro Plus分析划痕愈合情况，计算划痕愈合率〔划痕愈合率=（0 h划痕宽度－24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%〕，代表细胞迁移能力。

1.5 免疫荧光染色观察PASMC中α-SMA表达情况

将PASMC以1×104个/孔的密度种植于含盖玻片的24孔板上，过夜培养至细胞爬片贴壁后，进行对应分组处理。采用PBS洗涤爬片，采用4%多聚甲醛溶液固定10 min，吸去多余液体，再次采用PBS洗涤后加入0.3%Triton X-100透化10 min，采用PBS洗涤，采用5%牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点。在玻片上滴加α-SMA兔多克隆抗体（1∶200），放入湿盒内于4 ℃孵育过夜。次日，采用PBS洗涤后滴加AlexaFluor 488荧光标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶500），常温下避光孵育2 h。采用PBS再次洗涤后，进行DAPI细胞核染色，采用抗荧光淬灭封片剂封固，晾干，荧光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况并拍照。

1.6 实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（real time quantity polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子（NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18）的mRNA相对表达量

采用TRIzol法提取各组PASMC总RNA，吸取1 μl总RNA样品，通过微量光度计测定样品纯度与浓度，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整性。按照cDNA第一链合成试剂盒说明书步骤反转录合成cDNA。通过ABI QuantStudio5定量PCR仪测定各目的基因mRNA相对表达量，根据探针法荧光定量PCR检测试剂盒说明书配置反应体系，混匀后置于定量系统上，设置反应条件为：95 ℃ 15 min，1个循环；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40个循环，各引物序列见表1，采用2-ΔΔCt法分析目的基因相对表达量，以β-actin为内参基因。实验重复3次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 Western blot法检测PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子（NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18）相对表达量

取各组PASMC，加入适量RIPA裂解液，冰上静置裂解30 min，于4 ℃条件下以12 000 r/min离心10 min（离心半径12.5 cm），获取上清液即为蛋白，采用Bradford法测定其浓度。将蛋白加热变性，将经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离变性后的等量蛋白电转至PVDF膜上，采用5%脱脂牛奶封闭非特异性结合位点后，分别加入稀释的HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18抗体液（1∶1 000），以GAPDH作为内参蛋白，于4 ℃孵育过夜。次日，加入稀释后的相应二抗液（1∶5 000），室温孵育1 h，滴加ECL试剂液覆盖，曝光显色，采用Image J软件分析各目的蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值之比作为蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.8 统计学方法

采用Gradpad Prism软件（8.0版本）进行数据处理。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖活力

C C K-8 法检测结果显示，对照组、低氧组、HMGB1 Ab组、HMGB1 Ab＋MSU组细胞增殖活力分别为（0.53±0.06）、（0.89±0.09）、（0.55±0.06）、（0.87±0.09）。四组细胞增殖活力比较，差异有统计学意义（F=32.514，P＜0.001）；其中低氧组细胞增殖活力高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMGB1 Ab组细胞增殖活力低于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMGB1 Ab＋MSU组细胞增殖活力高于HMGB1 Ab组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 细胞迁移能力

细胞划痕实验检测结果显示，对照组、低氧组、HMGB1 Ab组、HMGB1 Ab＋MSU组划痕愈合率分别为（40.25±4.21）%、（77.56±7.94）%、（41.68±4.30）%、（76.67±7.82）%。四组划痕愈合率比较，差异有统计学意义（F=241.996，P＜0.001）；其中低氧组划痕愈合率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMGB1 Ab组划痕愈合率低于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMGB1 Ab＋MSU组划痕愈合率高于HMGB1 Ab组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 PASMC中α-SMA表达情况

免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，低氧组细胞荧光染色强度明显增强，α-SMA表达增加；与低氧组比较，HMGB1 Ab组细胞荧光染色强度明显减弱，α-SMA表达减少；与HMGB1 Ab组比较，HMGB1 Ab＋MSU组细胞荧光染色强度明显增强，α-SMA表达增加，见图1。

图1 各组PASMC中α-SMA表达情况（免疫荧光染色，×100）Figure 1 Expression of α-SMA in PASMC in each group

2.4 PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子的mRNA相对表达量

qRT-PCR检测结果显示，四组PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中低氧组PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMGB1 Ab组PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA相对表达量低于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMGB1 Ab＋MSU组PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA相对表达量高于HMGB1 Ab组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 四组PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子的mRNA相对表达量比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC among the four groups

表2 四组PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子的mRNA相对表达量比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC among the four groups

注：HMGB1 Ab=高迁移率族蛋白1中和抗体，MSU=单钠尿酸盐；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与低氧组比较，P＜0.05；c表示与HMGB1 Ab组比较，P＜0.05。

组别HMGB1NLRP3Caspase-1GSDMDIL-1βIL-18对照组1.00±0.061.00±0.051.00±0.061.00±0.061.00±0.051.00±0.06低氧组HMGB1 Ab1.86±0.19a1.72±0.18a1.79±0.18a2.24±0.22a2.30±0.24a1.84±0.18a组1.16±0.11b1.31±0.13b1.35±0.13b1.51±0.13b0.98±0.09b1.01±0.10b HMGB1 Ab＋MSU组1.76±0.11c1.74±0.17c1.76±0.18c2.05±0.21c2.04±0.20c1.80±0.17c F值53.54038.12742.39478.64395.70160.228 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.5 PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子相对表达量

W e s t e r n b l o t 检测结果显示，四组P A S M C中H M G B 1、N L R P 3、C a s p a s e-1、G S D M D、IL-1β、IL-18相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中低氧组PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMGB1 Ab组PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18相对表达量低于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMGB1 Ab＋MSU组PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18相对表达量高于HMGB1 Ab组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图2。

图2 Western blot法检测四组PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子相对表达量的SDS-PAGE图Figure 2 Electrophoretic map of protein relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC of four groups

表3 四组PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子相对表达量比较（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC among the four groups

表3 四组PASMC中HMGB1及细胞焦亡相关因子相对表达量比较（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC among the four groups

注：a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与低氧组比较，P＜0.05；c表示与HMGB1 Ab组比较，P＜0.05。

组别HMGB1NLRP3Caspase-1GSDMDIL-1βIL-18对照组低氧组0.26±0.030.08±0.010.19±0.020.35±0.030.30±0.030.28±0.03 0.94±0.09a0.76±0.08a0.83±0.08a1.10±0.12a1.18±0.13a0.94±0.09a HMGB1 Ab组0.21±0.02b0.14±0.01b0.29±0.03b0.37±0.04b0.18±0.02b0.26±0.03b HMGB1 Ab＋MSU组0.89±0.08c0.77±0.08c0.81±0.08c1.02±0.10c1.01±0.11c0.92±0.10c F值36.21528.49033.54350.21147.76935.608 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 讨论

PAH作为一种慢性破坏性心肺疾病，对人类健康造成严重威胁，遗传因素和环境因素均是PAH发生发展的主要因素，长期暴露于高海拔或继发性肺部疾病状态可造成肺泡缺氧，导致肺动脉压逐渐升高，造成心肺结构与功能被破坏［7-8］。PASMC具有收缩和舒张功能，可调节血压和血流量，维持血液循环。正常状态下，PASMC处于稳定的终末分化阶段，表现为收缩型；而缺氧引起血管收缩异常，导致肺血管阻力可逆性增加，使PASMC由收缩型向合成型转化，并获得异常的增殖和迁移能力，引起肺血管重塑［9］。α-SMA是PASMC由收缩型向合成型转化的标志物［10］。为了探索PAH发展的机制及有效治疗方案，通常采用低氧诱导PASMC来模拟体外PAH模型。本研究结果显示，低氧状态下PASMC增殖、迁移能力异常增高，α-SMA表达也明显增加。

HMGB1是一种普遍存在的DNA结合蛋白，在各种病理生理过程中起着重要作用。HMGB1可以从坏死或受损细胞中被动释放，在低氧条件下也可以由免疫细胞或组织主动分泌。当HMGB1进入细胞外空间时，能够与受体结合，并作为损伤相关分子发挥作用；此外，HMGB1还通过作用于模式识别受体来传导细胞信号，诱导促炎细胞因子的释放，并加速炎症反应［11-13］。目前，大量研究表明，HMGB1在PAH的发病过程中发挥重要作用，其可能是PAH的潜在治疗靶点［14-15］。ZABINI等［16］在特发性PAH和PAH患者血清中均检测到HMGB1水平升高，并发现HMGB1通过激活c-Jun氨基末端激酶而促进PASMC和原代人动脉内皮细胞（primary arterial endothelial cell，PAEC）的增殖，从而诱导血管重塑；ZHANG等［17］研究表明，HMGB1通过上调内质网应激相关蛋白表达而促进PASMC的增殖和迁移，并发现利用甘草酸干扰HMGB1表达或4-苯基丁酸抑制内质网应激均能够减缓PAH的进展；LI等［18］研究指出，HMGB1介导的晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）表达的增加促进了炎症反应，导致严重的肺功能障碍，加重了缺氧性PAH的症状。本研究结果显示，加入HMGB1 Ab处理后，PASMC增殖、迁移能力降低，α-SMA表达也明显减少，表明HMGB1 Ab能够抑制低氧诱导的PASMC异常增殖与迁移。

细胞焦亡是不同于凋亡和坏死的细胞死亡形式，NLRP3炎症小体是介导细胞焦亡的关键因子，其与ASC相互作用，募集Caspase-1前体并促进Caspase-1成熟体的产生，一方面，激活的Caspase-1剪切GSDMD后形成GSDMD-N端片段，该片段与脂质结合后会破坏细胞膜，并释放大量促炎因子；另一方面，激活的Caspase-1促进促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟与释放，从而招募炎性细胞聚集，加重炎症反应［19-21］。近年来，关于细胞焦亡参与PAH的研究报道越来越多，在低氧状态下PASMC焦亡水平明显增加，而敲低PASMC中的程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-1）可抑制细胞焦亡，并减轻肺血管纤维化［22］；低氧可诱导胶质瘤相关癌基因家族锌指1（gliomaassociated oncogene family zinc finger 1，GLI1）异常表达，而抑制GLI1可减弱PASMC焦亡，起到抑制PAH进展的作用［23］；敲低驱动蛋白家族成员23（kinesin family member 23，KIF23）可抑制PASMC焦亡和增殖，进而抑制PAH中肺动脉压升高、右心室肥厚和降低肺血管阻力［24］。本研究结果显示，HMGB1 Ab可以抑制PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA及其蛋白相对表达量，推测HMGB1 Ab抑制低氧诱导的PASMC异常增殖与迁移的作用可能与调控细胞焦亡有关。为了进一步验证这一推测，采用NLRP3炎症小体激动剂——MSU处理PASMC，结果显示，PASMC增殖、迁移能力又明显升高，α-SMA表达明显增加，同时HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA及其蛋白相对表达量升高，提示HMGB1 Ab通过抑制细胞焦亡来抑制低氧诱导的PASMC异常增殖与迁移。

4 结论

综上所述，HMGB1与低氧状态下PASMC增殖、迁移相关，HMGB1 Ab能够抑制低氧诱导的PASMC异常增殖与迁移，该作用与其抑制细胞焦亡有关，这可为PAH的治疗提供新思路。但本研究仅从细胞水平上证实了HMGB1对低氧状态下PASMC的影响，而HMGB1参与PAH发生发展的具体机制仍未完全阐明，HMGB1 Ab能否在体内通过抑制PASMC异常增殖和迁移来改善肺血管重塑仍有待进一步探讨。

作者贡献：李鸣远、武云进行文章的构思与设计；李鸣远、李倩进行研究的实施与可行性分析，资料收集、整理；李鸣远进行论文撰写，统计学处理；武云进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。