肺癌组织中ERO1L、TNFRSF4的表达与患者免疫功能、炎症反应因子及预后的关系

戚新新 苗丽君 李晓萍 黄凤祥

肺部癌变的发生主要由于吸烟和大气污染,肺癌是全世界高发生率和高死亡率的癌症[1]。按照组织病理学特征,将其分为小细胞癌症和非小细胞癌症[2]。通过手术切除癌变组织是肺癌的首选治疗方案,但术后会出现复发和转移,患者免疫功能也会有所降低,预后达不到理想要求[3]。内质网氧化物蛋白(endoplasmic reticulum oxidoreductin-1-like protein,ERO1L)是一种定位于内质网管腔的糖蛋白,具有氧化还原酶的作用[4-5]。在人类恶性肿瘤中,ERO1L大多都会过度表达,其过度表达与恶性肿瘤的生长、增殖和转移有关[6]。同时,ERO1L的表达水平与炎症相关因子IL-10和TGF-β的表达有关[7]。肿瘤坏死因子受体4(TNF receptor super-family member 4,TNFRSF4)是肿瘤坏死因子超家族的一员,作为免疫检查点可以调节免疫共刺激通路[8]。TNFRSF4与细胞存活和增强细胞毒性有关,TNFRSF4上调表达可以增强T细胞增殖以及杀伤细胞的能力[9]。因此,本研究通过检测肺癌组织中ERO1L、TNFRSF4 mRNA和蛋白表达水平,以及肺癌患者免疫功能指标和炎症因子水平,探讨ERO1L、TNFRSF4与免疫功能、炎症因子及患者预后的关系。

资料与方法

一、研究对象

选取2018年7月～2020年7月期间在本院住院手术的108例肺癌患者,年龄50～70岁,平均年龄(60.15±8.95)岁;男59例,女49例,收集手术中切除的肺癌组织及其癌旁组织。

纳入标准:①符合肺癌诊断标准[10],并经病理确诊。②一般临床资料及随访资料完整。③无其他恶性肿瘤或免疫疾病。

排除标准:①合并其它脏器衰竭。②已进行放疗、化疗等治疗。③有靶向药治疗经历。纳入患者均签署知情同意书,本研究已被医院伦理委员会批准(20170716553)。

二、研究方法

1. qRT-PCR法检测肺癌组织与癌旁组织中ERO1L、TNFRSF4 mRNA表达水平

使用Trizol试剂盒(货号:SWFZ028,上海信帆生物科技有限公司)提取肺癌组织以及癌旁组织的总RNA,反转录试剂盒(货号:F0202-100T,北京兰博利德商贸有限公司)将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板采用qRT-PCR法检测,使用2-ΔΔCt方法计算ERO1L和TNFRSF4的mRNA相对表达量,内参基因为β-actin,引物由擎科生物有限公司合成,引物序列(见表1)。

表1 qRT-PCR所需引物名称及序列

2. 免疫组化法检测肺癌组织中ERO1L、TNFRSF4蛋白表达水平

参考免疫组织化学染色试剂盒(货号:E-IR-R217,武汉伊莱瑞特生物科技股份公司)说明书,检测肺癌组织和癌旁组织中ERO1L、TNFRSF4蛋白表达水平,ERO1L、TNFRSF4抗体(货号:ab177156、ab229021)均购自Abcam公司。按照阳性细胞百分比和着色强度评分:阳性细胞百分比<5%计0分,5%≤阳性细胞百分比<25%计1分,25%≤阳性细胞百分比<50%计2分,50%≤阳性细胞百分比<75%计3分,阳性细胞百分比≥75%计4分;阳性着色强度:无色0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。染色指数=阳性细胞百分比×着色强度,根据染色指数分:0分≤低表达≤4分,5分≤高表达≤12分。

3. 免疫功能指标和炎症因子检测

采集肺癌患者手术前空腹静脉血8 mL,使用流式细胞检测仪检测免疫T淋巴细胞亚群,包括CD3+,CD4+,CD4+/CD8+等免疫功能指标。使用IL-1β ELISA试剂盒(货号:XY0323A,上海煊雅生物科技有限公司)、IL-6 ELISA试剂盒(货号:IB-E10049,江西艾博因生物科技有限公司)、TNF-α ELISA试剂盒(货号:B3400,上海名劲生物科技有限公司)检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

二、随访

主要采用电话联系和患者门诊复查的方式,对本院进行手术治疗的肺癌患者进行为期3年的跟踪随访,本研究的随访率为100%,生存时间为术后日期至患者死亡日期或者最终随访截止时间(2023年7月)。

三、统计学分析

结 果

一、肺癌组织与癌旁组织中ERO1L、TNFRSF4 mRNA表达水平比较

肺癌组织中ERO1L mRNA(1.29±0.24)表达水平显著高于癌旁组织(1.06±0.15),TNFRSF4 mRNA(0.85±0.13)表达水平显著低于癌旁组织(1.08±0.16)(P<0.05)(见表2)。

表2 肺癌组织与癌旁组织中ERO1L、TNFRSF4 mRNA表达情况

二、肺癌组织与癌旁组织中ERO1L、TNFRSF4蛋白表达情况

ERO1L蛋白在肺癌组织中的高表达率为53.70%,显著高于癌旁组织(37.04%),差异具有统计学意义(P<0.05);TNFRSF4蛋白在肺癌组织的高表达率为54.63%,显著低于癌旁组织(68.52%),差异具有统计学意义(P<0.05)(见图1,表3)。

图1 免疫组织化学法检测肺癌组织和癌旁组织中ERO1L、TNFRSF4蛋白的表达情况(×100)

表3 ERO1L、TNFRSF4蛋白在肺癌组织和癌旁组织中表达水平比较[n(%)]

三、肺癌组织中不同ERO1L、TNFRSF4表达水平与患者临床特征的关系

ERO1L、TNFRSF4的表达水平与肺癌患者的年龄、性别无关(P>0.05),而与患者的肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)(见表4)。

表4 肺癌组织中不同ERO1L、TNFRSF4表达水平与患者临床特征的关系[n(%)]

四、肺癌组织中不同ERO1L、TNFRSF4表达水平的患者免疫功能和炎症因子比较

与ERO1L高表达组相比,ERO1L低表达组患者免疫功能指标CD3+、CD4+显著升高,CD4+/CD8+显著降低,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α显著降低(P<0.05);与TNFRSF4高表达组相比,TNFRSF4低表达组患者免疫功能指标CD3+、CD4+显著降低,CD4+/CD8+显著升高,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α显著升高(P<0.05)(见表5)。

表5 不同ERO1L、TNFRSF4表达水平的患者免疫功能和炎症因子指标比较

五、肺癌组织中ERO1L、TNFRSF4表达水平与患者预后的关系

肺癌组织中ERO1L高表达组患者3年累积生存率为37.93%(22/58),低于ERO1L低表达组52.00%(26/50)(Log rank χ2=6.100,P=0.014);肺癌组织中TNFRSF4高表达组患者3年累积生存率为54.24%(32/59),高于TNFRSF4低表达组32.65%(16/49)(Log rank χ2=11.296,P=0.001)(如图2,3)。

图2 ERO1L表达水平与肺癌患者3年累积生存率的关系

图3 TNFRSF4表达水平和肺癌患者3年累积生存率的关系

六、影响肺癌患者生存率的相关因素分析

以患者预后(死亡=1,生存=0)为因变量,以肿瘤大小(≥3cm=1,<3cm=0)、分化程度(低中分化=1,高分化=0)、TNM分期(Ⅲ-Ⅳ期=1,Ⅰ-Ⅱ期=0)、淋巴结转移(是=1,否=0)以及ERO1L(高表达=1,低表达=0)和TNFRSF4(高表达=1,低表达=0)为自变量,对其进行单因素Logistic回归分析和多因素Cox回归分析。

单因素分析显示:肺癌患者的生存率与分化程度、TNM分期、淋巴结转移、ERO1L和TNFRSF4表达水平有关(P<0.05),将上述因素进行多因素分析,发现肺癌组织的低分化、淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期、ERO1L高表达、TNFRSF4低表达是影响患者生存率的危险因素(见表6)。

表6 影响肺癌患者生存率的相关因素分析

讨 论

近年来,肺癌的死亡率居高不下,严重威胁到了人类的生命安全[11],肺癌的发生通常伴随免疫功能指标和炎症因子水平的改变,深入研究肺癌的发病机制,对肺癌患者的早期诊断及治疗方案的制定具有重要意义[12]。

ERO1L是一种内质网上的氧化酶,其生物学功能是调节缺氧诱导的氧化蛋白质折叠[13]。研究表明,ERO1L的上调表达与免疫抑制细胞的浸润密切相关,在肿瘤免疫抑制、肿瘤血管生成以及肿瘤的转移过程中发挥重要作用[14]。本研究检测肺癌患者癌组织中ERO1L的表达水平,结果发现,肺癌组织中ERO1L mRNA表达水平显著高于癌旁组织;免疫组织化学法观察发现,ERO1L蛋白在肺癌组织中的高表达率显著高于癌旁组织,提示肺癌组织中ERO1L上调表达。通过检测肺癌患者免疫功能指标和炎症因子水平发现,肺癌组织中ERO1L蛋白高表达组患者CD3+,CD4+显著低于低表达组,IL-1β、IL-6、TNF-α显著高于低表达组。提示ERO1L表达可能与肺癌患者的免疫功能和炎症反应因子有关。另有研究显示,ERO1L还可以促进肝细胞癌的转移和血管生成,与肝细胞癌患者的生存率和预后不良具有显著相关性[15],本研究采用Kaplan-Meier法分析ERO1L蛋白表达水平与肺癌患者预后的关系,发现ERO1L高表达组患者3年累积生存率低于ERO1L低表达组,提示ERO1L上调不利于肺癌患者预后。

TNFRSF4又称OX40,其已知配体为TNFSF4,TNFRSF4与TNFSF4相互作用可以成功抵御乙肝病毒,并增强免疫强度[16]。本研究检测肺癌患者癌组织和癌旁组织中TNFRSF4表达水平,结果发现,肺癌组织中TNFRSF4 mRNA表达水平显著低于癌旁组织,免疫组织化学法检测发现,肺癌组织中TNFRSF4蛋白高表达率低于癌旁组织,提示TNFRSF4表达可能与肺癌的发生有关系。TNFRSF4可以稳定维持肿瘤微环境的免疫调节特性,使得肿瘤患者预后良好[17]。TNFRSF4也作为刺激分子信号,有效促进T细胞的活化、增殖以及分化[18],在人类细胞免疫中发挥重要作用[19]。本研究中,肺癌组织TNFRSF4蛋白高表达组患者的免疫功能指标CD3+、CD4+高于低表达组,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著低于低表达组,提示TNFRSF4上调表达可提高肺癌患者免疫功能,抑制炎症反应因子表达。采用Kaplan-Meier法分析TNFRSF4蛋白表达水平与肺癌患者预后的关系,发现TNFRSF4高表达组患者3年累积生存率高于TNFRSF4低表达组,提示TNFRSF4上调有利于肺癌患者预后。

通过Cox多因素分析发现,肺癌组织的低分化、淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期、ERO1L高表达、TNFRSF4低表达是影响患者生存率的危险因素。

综上所述,肺癌组织中ERO1L上调表达,TNFRSF4下调表达,ERO1L和TNFRSF4表达水平与肺癌患者的免疫功能和炎症反应因子水平存在一定的关系,且ERO1L和TNFRSF4的表达水平与肺癌患者的生存率相关,检测肺癌组织中ERO1L和TNFRSF4表达水平,对改善患者预后生存情况具有重要价值。本研究的不足之处在于纳入的样本量较少、仅收集同一医院的病例,后续会通过多中心研究,扩大样本量,深入探究并验证ERO1L、TNFRSF4与肺癌患者免疫功能、炎症反应及预后的关系。