赖氨酰氧化酶在肺动脉高压中的相关性研究

文浩 成孟瑜

PH是指由多种异源性疾病(病因)和不同发病机制所致肺血管结构或功能改变,引起肺血管阻力和肺动脉压力升高的临床和病理生理综合征,继而发展成右心衰竭甚至死亡,是一种严重的心血管疾病,目前诊断主要依赖超声心动图筛查,但受超声诊断医师经验影响,右心导管检查作为金标准因其有创性未能广泛应用。有相关研究证实,赖氨酰氧化酶蛋白家族与PH的发生、发展有密切关系,本文旨在综述近年来有关LOS在PH中的相关研究进展,以期为该病的预后评估和治疗提供新思路和目标。

一、赖氨酰氧化酶蛋白家族

LOS在许多生理和病理过程中发挥着重要作用,其活性导致细胞外蛋白质的共价交联,增加抗拉伸强度和抵抗蛋白质水解。LOS在细胞粘附和运动、形态发生、结构完整性维护、组织修复、新血管生成和血管重构、上皮-间质转化和内皮-间质转化中发挥着重要的生理功能[1]。在正常发育过程中表达受到严格的调节,异常的表达和活性在多种病理性纤维化疾病中发挥作用[2],如肝硬化、肺纤维化和心力衰竭、肺血管系统增生性和闭塞性重构、多种癌症有关。

基于赖氨酰氧化酶基因结构上的同源和相似性,该家族分为赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)、赖氨酰氧化酶样蛋白1(Lysyl Oxidase Like1, LOXL1)、赖氨酰氧化酶样蛋白2(Lysyl Oxidase Like 2,LOXL2)、赖氨酰氧化酶样蛋白3(Lysyl Oxidase Like 3,LOXL3)、赖氨酰氧化酶样蛋白4(Lysyl Oxidase Like 4,LOXL4)。LOS在蛋白C端均具有高度保守的催化结构域,包含有赖氨酸酪氨酰醌(Lysyl-tyrosyl-quinone,LTQ)辅因子、铜结合位点及细胞因子受体样结构域(cytokine receptor-like domain,CRL),这是蛋白质构象和催化活性所必须的。又根据可变的蛋白N末端将LOS分为LOX、LOXL1与LOXL2-4两组。LOXL2-4在其N端有一个共同的结构,包括四个串联重复的清除率-受体-富半胱氨酸域(scavenger receptor cysteine-rich ,SRCR),该结构域包含蛋白质-蛋白质相互作用位点。而LOX和LOXL1缺乏SRCR结构域,但在N端有一个前肽序列,该序列经过细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中骨形态发生蛋白-1 (Bone Morphogenetic Protein-1,BMP-1)或去整合素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)蛋白的蛋白裂解,进而产生有活性的LOX及LOXL1[3]。LOS结构(见图1)。

图1 赖氨氧化酶家族结构模式图: LOS共有一个高度保守的C端结构域,包括一个铜结合位点、LTQ和CRL,这是蛋白质构象和活性所必需的。LOX和LOXL1含有前序列,它们在分泌到细胞外基质之前被骨形态发生蛋白1切制。LOXL2-4N端均有四个串联重复的清除率-受体-富半晚氨酸域,被认为介导细胞粘附和蛋白质相互作用

二、肺动脉高压

PH是一种危险的心血管疾病[4],其主要特征是肺动脉的内膜增殖伴炎症反应、内皮间质化,甚至形成向心性或偏心性改变;中膜肥厚及持续的收缩、外膜纤维化、基质重塑以及肺小血管周围炎症浸润而导致其增厚、滋养血管屈曲增生形成丛状病变;还可见病变远端扩张和原位血栓形成,从而导致肺动脉管腔进行性狭窄、闭塞。PH发病机制复杂,是多因素、多环节共同作用的结果;包括外因(低氧、烟草、粉尘、其他理化因素)、内因(遗传、发育、结构、疾病等)及交互因素(微生态、感染、免疫、药物等),其发生发展涉及多种血管活性分子、多种离子通道及多条信号通路。目前的研究表明,PH的发病机制与LOS的表达和调节密切相关。本文就LOS在PH中的相关研究进行综述,指出LOS可能是PH预后不良的生物标志物。

1. LOS在特发性肺动脉高压中的相关性研究

Nave等[5]通过评估在特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary artery hypertension, IPAH)与人表面健康的肺供体移植肺组织中LOS的mRNA及蛋白水平,发现相较于健康对照组,IPAH肺组织中的LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL4 mRNA表达分别相对增加约9.2倍、3.9倍、2.8倍、2.2倍,LOX和LOXL2蛋白表达增加,而未观察到LOXL3基因或蛋白表达的变化。进一步将肺血管分离,蛋白染色显示肺血管可见5种LOS分布,IPAH肺血管中动脉平滑肌细胞增多、内弹性板破坏,LOXL2和LOXL3基因表达水平升高,LOX表达水平也有升高的趋势,血管中未检测出LOXL4,表明LOS的表达在IPAH肺组织以及重塑血管中是失调的。在21%氧气浓度或10%低氧条件下培养肺动脉平滑肌细胞和外膜成纤维细胞,24小时后筛选LOX基因表达。发现在外膜成纤维细胞中,IPAH组LOX的缺氧反应比供体肺组更明显,LOXL1、 LOXL2也有缺氧反应。肺动脉平滑肌细胞中,两组LOX基线表达水平最高,IPAH组基线LOXL4水平升高。这些数据表明,LOS在肺血管系统的组成血管细胞类型中表达,且可以被低氧张力所调节。

内皮素-1在肺动脉高压中的作用已被广泛表明[6],其可通过与肺血管平滑肌细胞中的内皮素受体A和B结合,引起血管收缩,促进有丝分裂进而促进血管重塑。Maruyama等[7]通过收集7例IPAH患者移植肺中的肺动脉作为实验组,12例术前经TTE除外PH的局限性肺癌患者的局灶肺叶切除肺中的肺动脉作为对照组进行体外培养。研究发现经内皮素-1刺激两组肺动脉平滑肌细胞,实时荧光PCR检测出两组LOX表达水平均增高,但IPAH组肺动脉平滑肌细胞LOX升高水平更显著;而经过前列环素或曲匹地尔作用后,发现实验组升高的LOX可恢复到基线水平,而不影响对照组LOX的表达。曲匹地尔及前列环素均能通过激活PKA作用于血管平滑肌细胞发挥其作用,活化的PKA磷酸化使cAMP反应元件结合蛋白(CREB)进入细胞核。CREB通过招募几个转录共激活因子增强其转录活性,从而控制靶基因的表达。IPAH组肺动脉平滑肌细胞对内皮素-1和曲匹地尔或前列环素反应中LOX独特的表达模式表明IPAH中可能存在PKA-CREB通路受损。这种差异及其在PKA-CREB通路中的分子有待进一步研究。

2. LOS在系统性硬化症相关性肺动脉高压中的相关性研究

系统性硬化症相关性肺动脉高压(systemic sclerosis-associated pulmonary arterial hypertension,SSC-PH)属于结缔组织病合并的肺动脉高压,是第一类肺动脉高压。系统性硬化症患者合并PH的发病率在30.51%[8],对于SSC-PH的具体机制,目前并不明确。Vadasz等[9]进行的一项多中心研究发现SSC患者血清LOX水平升高,且LOX水平和DLCO之间呈负相关,其中又根据经胸超声心动图筛查发现肺动脉收缩压>40mmHg及经右心导管检查发现合并PH的患者血清LOX水平明显高于无PH的系统性硬化症患者,经过3-5年随访发现这些LOX水平更高的患者往往死亡率或肺移植率更高。该研究从肺活检中发现重建的肺血管的内皮细胞是其LOX的主要来源之一,且免疫荧光显示SSC-PH组与IPAH组、对照组相比,免疫染色更强。该研究确定了LOX是SSc-PH患者严重程度的一个生物标志物,且与不良预后相关,这与Yoneda K的研究一致[10]。

3. LOS在先天性疾病中的相关性研究

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia,CDH)是一种由于膈肌不能正常形成,腹腔脏器经缺损出疝入胸腔,造成解剖关系异常,引起一系列病理、生理变化的先天性疾病,肺血管往往合并严重的肺动脉高压,总生存率为70%[11]。Monroe等[12]通过量化先天性膈疝合并肺动脉高压(congenital diaphragmatic hernia -associated pulmonary hypertension,CDH-PH)的肺动脉主干细胞外基质的结构、成分和机械变化,发现肺动脉主干的血管厚度增加,LOX表达增加,极限抗拉强度与健康对照组25.1 MPa相比降低了13.6 MPa,表明CDH-PH组肺动脉主干ECM结构发生紊乱。LOX活性的上调会导致纤维胶原和弹性蛋白交联活性的增加,减低LOX水平后ECM结构紊乱在一定程度上得到了减轻。

4. LOS在低氧性肺动脉高压中的相关性研究

慢性缺氧在低氧性肺动脉高压中起关键的作用,其诱导大量细胞因子释放导致肺动脉压升高,而升高的肺动脉压反过来诱导细胞因子,建立了一个恶性循环,加剧了其发病和进展。此外,低氧性肺动脉高压往往由于肺血管的代偿作用,不易被早期发现,死亡率较高[13]。有生物信息研究在微阵列数据集中验证得出LOX在缺氧触发的血管生成中通过上调血管内皮生长因子来间接发挥作用[1]。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种常见的导致低氧性肺动脉高压的呼吸道疾病,发病率越来越高,约30%～70%的COPD患者合并有PH,平均肺动脉压>25mmHg者,5年生存率由62.2%下降到36.3%[15]。Migulina Nataliya等[16]发现吸烟患者及COPD患者小气道中LOS家族有不同的表达,LOX、LOXL1、LOXL2的表达增加能够促进小气道胶原蛋白的交联以及异常沉积,最终导致气道重塑。而Besiktepe等发现通过提高LOX、LOXL1、LOXL2蛋白水平的方法可以减少COPD患者的不良肺气肿改变[17]。

陈伟谦等[18]通过大鼠模型研究缺氧和/或高碳酸血症时LOX以及细胞外基质胶原蛋白的交联变化,发现缺氧条件下大鼠平均肺动脉压、右心室/(左心室+室间隔)重量比、肺动脉血管壁面积、血管总面积均明显高于常氧组,且肺组织LOX酶活性、mRNA及蛋白水平在肺中小动脉平滑肌肺泡上皮细胞表达均显著高于常氧组。缺氧上调LOX表达,由此促进胶原交联显著增加,诱使肺动脉高压的形成和血管结构重建。Xia Xiaodong、彭燕平也有相同的发现,除此之外研究表明,TGF-β1参与了LOX的调节,且高碳酸血症可以抑制TGF-β1信号通路下调缺氧诱导的LOX的表达[19, 20]。低氧大鼠肺动脉LOX表达和胶原交联呈PI3K/AKT依赖性,而LOXL1-4与该信号通路无关[21]。

低氧性肺动脉高压小鼠在慢性缺氧条件下,除了LOX表达水平增高,肺组织及肺动脉中铜转运蛋白CTR1、铜伴侣蛋白SOD、ATOX1的表达也增加,进而细胞内铜摄取增加,通过依赖HIF-1α机制又将导致铜转运蛋白、铜伴侣蛋白、LOX表达增加,形成一个恶性循环[22]。

5. LOS在实验性肺动脉高压中的相关性研究

Nave[5]在21%氧气浓度或10%低氧条件下分别培养小鼠,发现缺氧小鼠在低氧后3h内LOX和LOXL2的表达迅速增加且持续增加24h,(同IPAH患者肺组织中LOX及LOXL2表达增加),LOX表达在低氧暴露整个时间内持续增加,表明LOX可能在PH的发展中发挥因果作用。而通过使用LOX广谱抑制剂β-氨基丙腈发现其减轻了低氧诱导的肺动脉高压、肺血管重塑,减轻了对胶原蛋白的交联及沉积,肺血流动力学改善和右室肥厚减弱。

Ariel[23]通过在定制的等双轴拉伸器水凝胶上培养肺动脉外膜成纤维细胞进行体外实验发现,与正常0.5kPa韧度的基质上相比,LOXL1和α-平滑肌肌动蛋白信使RNA的表达仅在3kPa韧度基质时随着拉伸和底物硬度的增加显著上调,而在10kPa韧度的基质上未见显著上调。不管体内外实验,动物或临床实验中,LOS的表达均证明与肺动脉压力相关。

6. LOS在其他肺动脉高压中的相关性研究

基质硬化与进行性肺纤维化密切相关,在特发性肺纤维化相关肺动脉高压中LOS也存在失调,Mark G. Jones[24]发现LOS抑制剂可减少病理性的吡啶啉交联,使胶原蛋白形态正常化,降低组织硬度并改善肺功能。而Tong X.[25]和Bei Liu等[26]在肺纤维化体外模型发现阿奇霉素、罗汉果有类似的效果,并可能通过部分抑制JNK/c-Jun和TGF-β1/Smad信号通路减少LOX、LOXL2的产生。

关于慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronic thromboembolic pulmonary hypertension,CTEPH)或其他肺动脉阻塞性病变所致肺动脉高压的相关研究报道较少,但Nave等学者研究已证实相较于健康人供体肺组织,在患者慢性血栓栓塞性肺动脉高压肺组织中LOS表达均异常,有待进一步研究。

毛细血管前肺动脉高压是骨髓增殖性肿瘤(myelodysplastic syndromes,MPN)包括真性红细胞增多症(polycythemia vera,PV)、特发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)和原发性骨髓纤维化(myelofibrosis,MF)的一种罕见且常常未被认可的并发症,往往危及生命[27]。研究证明,LOX在MPN进展及血栓形成中发挥一定的作用[28]。MPN中肿瘤巨核细胞通过分泌TGF-β和LOX,促进骨髓纤维化。LOX氧化基质细胞和巨核细胞表面的血小板衍生生长因子受体,增强配体与受体的亲和力,促进肿瘤巨核细胞的增殖。LOX增加血小板的活化和对胶原的粘附,促进血栓形成。法国PH登记处研究随访90名MPN患者(42例PV,35例ET,13例原发性MF),均表现为严重的毛细血管前肺动脉高压PH,中位平均肺动脉压和肺血管阻力分别为42 mmHg和6.7 WU,临床状况受损,71%的患者处于NYHA功能分级Ⅲ/Ⅳ级,并且中位6分钟步行距离为310米。一半的患者被诊断为CTEPH,另一半被认为是第5类PH。MF与第5类PH的关联性较强,而在没有MF的PV和ET患者中通常与CTEPH相关。一半的CTEPH患者被诊断为近端病变。在18名高风险患者中进行了血栓内膜切除术,其中5人死亡。第5类PH的1、3和5年总生存率分别为67%、50%和34%,CTEPH的总生存率分别为81%、66%和42%,生存率整体不容乐观[28]。

三、总结与展望

LOS在临床和实验性肺动脉高压中均表达异常,水平直接关系到弹性蛋白和胶原的交联以及弹性蛋白和胶原纤维的结构和稳定性,且可能作为与PH严重程度相关的生物标志物,有望为PH的治疗提供新的思路和理论依据。关于LOS在肺动脉高压中的作用仍需要更深入的研究,可以进一步探索LOX和LOXL的信号通路、作用机制和对肺动脉平滑肌细胞以及内皮细胞的具体作用;开发针对LOX和LOXL的新型药物并通过建立动物体内肺动脉高压的模型,验证LOX和LOXL在治疗中的效果等等。此外,目前现有研究中大都是对于各型肺动脉高压在组织中的LOS表达,且以LOX居多,对于血清学中LOS表达水平仍没有过多研究,可以进一步测定各型肺动脉高压中LOS血清学浓度,进而分析LOS是否可以早期识别PH并且与预后相关联。