盐酸安罗替尼联合多西他赛对肺癌大鼠血小板凝聚、EGFR-STAT3信号通路及抑瘤作用研究

杨菊菊 詹莉琼 崔伟建 任中海

肺癌近年来患病率居高不下,疾病期肿瘤细胞此时可释放凝血酶增强血小板聚集功能[1]。而STATs家族在细胞生长、凋亡过程中具有调控作用,其中信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)与肺癌间关系密切,可通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)-STAT3信号转导机制发挥作用。对于晚期的患者而言临床主要采用化疗治疗[2]。多西他赛为一种半合成衍生物和抗微管药物,可参与肿瘤DNA、RNA及蛋白合成调控,还在微管调节中维持机体稳定性[3]。安罗替尼属多靶点酪氨酸激酶抑制剂,可在调控表皮生长因子受体及其他相关因子的同时阻止肿瘤细胞恶性增殖,且在结直肠癌、胃癌、肺癌等疾病治疗中具有良好效果[4-6]。由此,本文展开对盐酸安罗替尼与多西他赛联合应用于肺癌中的治疗作用。

资料与方法

一、实验对象

1. 实验大鼠

选取清洁级Wistar大鼠雄性50只,体重120～160g,4～6月龄,均由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(黑)2008004,动物常规饲养于我院实验动物中心,适应性喂养1周后进行实验。

2. 仪器与试剂

多西他赛(江苏恒瑞 医 药 股 份有限公司,批准文号:国药准字H20163032;盐酸安罗替尼(正大天晴药业集团股份有限公司,规格:12mg,国药准字:H20180004);ADP腺苷二磷酸(批号:STY5020223);全自动生化分析仪(上海聚慕医疗器械有限公司,货号Atellica CH930);电子天平(北京赛多斯仪器系统有限公司,型号:BS-124s );正置型金相显微镜(上海光学仪器厂,型号:SG-51);放射免疫分析测定盒(上海信裕生物科技有限公司,货号:xY-10094);电泳仪(武汉纯度生物科技有限公司,货号:CD-11255-ML);流式细胞仪(杭州昊鑫生物科技股份有限公司,货号:HY-15941);荧光定量PCR试剂盒(上海抚生实业有限公司,货号FS01P1361)。

二、方法

1. 肺癌大鼠模型建立

除健康组10只外其余均建立肺癌大鼠模型。造模前3d为防止大鼠的肺组织发生炎症及感染现象均适当给予青霉素和链霉素进行干预。将大鼠麻醉处理后,用橡皮筋固定四肢于实验板上,自剑突下沿腹正中剪去体毛,逐层开腹暴露大鼠腹腔在肺部注射0.5mL的1×107个/ mL A549细胞,待肿瘤直径长约1cm为建模成功,造模后1周开始后续实验。

2. 分组与给药

将50只大鼠随机分为健康组、模型组、盐酸安罗替尼组、多西他赛组、联合组,平均10只/组,建模后,健康组与模型组大鼠采用等量生理盐水灌胃干预;多西他赛组采用在大鼠静脉注射多西他赛0.3mg/kg(按体表面积折算约为临床推荐剂量的1/50);盐酸安罗替尼组依据体表面积进行换算,采用盐酸安罗替尼1.2 mg/kg灌胃治疗;联合组予以盐酸安罗替尼联合多西他赛联合干预治疗,在静脉注射0.3mg/kg多西他赛注射液的同时予以盐酸安罗替尼1.2 mg/kg灌胃治疗,均1次/d,连续干预30d。

三、检测指标

1. 血小板凝聚检测

取5mL抗凝血液样本1000 r/min离心15 min,取上层液得到富血小板血浆予以试验。将吸取富血小板血浆后剩余血液继以3000 r/min 离心10 min,取上清液,将血小板计数为(10～100)×1010个/L,分别精密吸取各组每只大鼠血浆和富血小板血浆各300 μL 加入测试容器内,将血浆透光率调至100%,将富血小板血浆37 ℃温育 1min ,加入0.155 μmol/L浓度的诱导剂ADP溶液10 μL,在分析仪中依据试剂盒说明对血小板聚集率进行分析检测。

2. 肿瘤体积变化

取出大鼠肺组织上的肿瘤并对瘤体体积进行测量,计算公式为瘤体体积(cm3)=(长度×宽度)2/2,统计肿瘤数量,对肿瘤进行拍照。

3. HE染色

腹腔麻醉处死大鼠,并取大鼠肺组织标本,采用100 g /L中性甲醛固定后,石蜡包理,5μm厚连续切片,进行常规HE染色,以观察肺组织病理改变。

4. 免疫印迹检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白

采用RIPA裂解液提取肺组织蛋白质,BCA法对蛋白定量处理,上样-电泳-转膜后采用脱脂牛奶进行封闭处理,加兔抗大鼠 EGFR(1 ∶700)、兔抗大鼠STAT3 ( 1 ∶1000 )、兔抗大鼠β-actin (1 ∶2000),4℃孵育过夜,将膜洗涤,加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶2000),37℃孵育1h,采用化学发光法显色后于暗室内曝光,经图像分析软件扫描取得目标蛋白吸光度值,以β-actin为内参。

5. qRT-PCR检测EGFR、STAT3 mRNA表达

采用 TRIzol 试剂提取肺组织总RNA,溶解于无RNase水后,使用紫外分光光度计检测样本总RNA,根据逆转录试剂盒说明的方法对cDNA进行合成。序列由上海生工生物工程公司合成。取10 μL逆转录产物,于荧光实时定量仪上进行循环反应,用2-△△Ct值法,以β-actin作为内参照定量EGFR、STAT3 mRNA 水平(见表1)。

表1 引物序列

四、统计学分析

采用Graphpad Prism8软件对本次研究结果进行统计学分析,实验数据符合正态分布,采用均值±标准差表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组大鼠血小板凝聚情况比较

与健康组比较,模型组大鼠的血小板聚集率显著升高(P<0.05);与模型组比较,盐酸安罗替尼组和多西他赛组大鼠的血小板聚集率显著降低(P<0.05);与盐酸安罗替尼组和多西他赛组比较,联合组大鼠的血小板聚集率显著降低(P<0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠血小板凝聚情况比较

二、各组肿瘤体积变化

模型组大鼠的肿瘤体积较高,与模型组比较,盐酸安罗替尼组和多西他赛组大鼠的肿瘤体积显著降低(P<0.05);与盐酸安罗替尼组和多西他赛组比较,联合组大鼠的肿瘤体积显著降低(P<0.05)(见表3,图1)。

图1 肿瘤体积变化

表3 各组大鼠肿瘤体积表达

三、HE染色

健康组大鼠肺组织生长良好,无明显损伤及病变反应,无上皮细胞脱落;模型组大鼠肺组织肺部病变明显,渗出减少,肺泡间隔水肿增宽,癌细胞扩张及小血管充血扩张明显,局部分布大量条索状、旋涡状病灶;盐酸安罗替尼组及多西他赛组大鼠肺组织仍可见部分纤维素样渗出同时伴随局部肺泡塌陷;联合组大鼠肺间质水肿明显改变,癌细胞明显减少,病变明显改变,仅存在少量小血管扩张充血及局部充血扩张改变(见图2)。

图2 肺组织 HE染色结果(×200,标尺=50μm)

四、各组大鼠肺组织中EGFR、STAT3蛋白比较

与健康组比较,模型组大鼠肺组织中EGFR、STAT3蛋白显著升高(P<0.05);与模型组比较,盐酸安罗替尼组和多西他赛组大鼠肺组织中EGFR、STAT3蛋白显著降低(P<0.05);与盐酸安罗替尼组和多西他赛组比较,联合组大鼠肺组织中EGFR、STAT3蛋白显著降低(P<0.05)(见表4,图3)。

图3 肺组织蛋白检测

表4 各组大鼠肺组织中EGFR、STAT3蛋白比较(n=10)

五、各组大鼠肺组织中EGFR、STAT3 mRNA比较

与健康组比较,模型组大鼠肺组织中EGFR、STAT3 mRNA显著升高(P<0.05);与模型组比较,盐酸安罗替尼组和多西他赛组大鼠肺组织中EGFR、STAT3 mRNA显著降低(P<0.05);与盐酸安罗替尼组和多西他赛组比较,联合组大鼠肺组织中EGFR、STAT3 mRNA显著降低(P<0.05)(见表5)。

表5 各组大鼠肺组织中EGFR、STAT3 mRNA比较(n=5)

讨 论

肺癌发病率居于全球恶性肿瘤的前列,对人类健康造成较大威胁[7-9]。多数患者在发现时已处于晚期阶段,以铂类双药联合干预的化疗方案通常为该类型疾病治疗的优选方案,同时在以多西他赛、盐酸安罗替尼为主的二线化疗方案也正在逐步应用于临床的治疗当中。但相关研究提示,在临床治疗上单一使用多西他赛临床效果并不显著,患者的远期生存情况也不甚理想[10]。因此,如何优化和提升二线化疗方案的治疗效力、增强治疗效果,以及提高晚期肺癌患者的预后,是现阶段关注的热点问题,并且也正在成为当前临床研究的主要方向。

肺癌的产生和转移均与血栓形成具有重要联系。血小板聚集功能通常代表着血小板之间的相互聚集能力,血小板根据这种性能不仅可进一步发挥其在机体中的凝血和止血功能,同时也会导致血栓形成[11]。本文研究结果显示,肺癌大鼠的血小板聚集率相对较高,在经药物干预后血小板聚集率均有所降低,其中以盐酸安罗替尼联合多西他赛治疗后血小板聚集率降低的最为显著。由于已经形成的肿瘤血栓因子在把肿瘤细胞包围后大大削弱了细胞因子的免疫活性,并在一定程度上避免了血液流量对其的清除效力。而当癌栓因子进入小血管后便可进一步产生转移效应,而分析其产生的关键使动因素则是血小板的黏附功能。盐酸安罗替尼通常与部分血管因子受体进行特异性结合进而抑制肿瘤新生血管的不断生成并降低其密度。而采用多西他赛与安罗替尼二者联合使用能够通过抑制机体内血小板的大量粘附,使胞中的内容物不再匮乏,进而削弱血小板的聚集、粘附状态,并通过释放部分内容物改善疾病引起的机体疲软状态。且有学者在研究中指出,多西他赛联合安罗替尼在晚期非小细胞肺癌的治疗中不仅对于延长患者生存寿命效果理想,还对抑制肿瘤疾病的恶性发展具有重要意义[12]。同时,另有研究表示,使用多西他赛联合其他药物用于晚期肺癌患者的治疗,不仅能够明显提高患者的远期治疗效果,还在改善患者的预后生存方面作用良好,且临床安全性也较高[13]。

肺癌产生时由于肺部常会生成大量的炎症因子及相关生长因子,引起成纤维细胞增生与转化,刺激肿瘤的恶性生长。本文结果显示,经药物干预后肺癌大鼠的肿瘤体积减小,其中以盐酸安罗替尼联合多西他赛组肿瘤体积减小的最为显著。安罗替尼不仅吸收能力迅速还能强化抑制肿瘤细胞增殖的相关酶活性,阻断部分下游信号异常传导。而多西他赛可与微管特异性结合维持微管双聚体装配稳定,阻碍微管网状结构重组,阻滞肿瘤细胞不断裂解[14]。但也有报道指出,单一使用多西他赛对疾病缓解效力仍有限,且长期用药也会伴随毒副作用[15]。而盐酸安罗替尼联合多西他赛可在协同作用基础上相互补充,有效抑制肿瘤血管恶性增长。有研究发现,安罗替尼联合多西他赛在晚期非小细胞肺癌治疗中作用良好,对延长患者预后生存具有重要意义[16]。以往研究表示,肿瘤细胞分化、增殖过程与信号传导通路相关,因此,对促进肿瘤生长的相关信号通路采取一定干扰、阻断措施可在一定程度上发挥良好的抗肿瘤作用[17]。EGFR作为表皮生长因子受体家族中一员,当与表皮生长因子或转化生长因子-α等配体相结合后会发生部分改变,使同源/异源二聚体形成。同时由于磷酸化C端的氨基酸残基的影响,进一步激活了EGFR的活性以及细胞内PI3K-AKT、JAK-STAT等多种下游信号参与肿瘤细胞的增殖过程当中[18]。本文研究结果显示,肺癌大鼠肺组织中EGFR、STAT3蛋白及mRNA均较高,经药物干预后,各组的EGFR、STAT3蛋白及mRNA均有所降低,其中以盐酸安罗替尼联合多西他赛组降低的最为显著。临床中多西他赛能发挥对癌细胞微管蛋白的聚集/解聚反应调节,并形成相对平稳的非功能微管蛋白束,达到抑制癌细胞生成目的。以往研究表明,多西他赛在多类晚期肿瘤中是较有效的支持性药物,可延长患者生存期[19-20]。二者协同作用可能通过下调STAT3及抑制EGFR阻断下游相关信号异常激活,起到抑制疾病发展的目的。由此可见,二者联合应用可发挥协同效应,即联合下调EGFR及STAT3,逆转癌细胞耐药机制。但对二者完全阻断的具体机制还需进一步研究。

综上所述,盐酸安罗替尼联合多西他赛对于改善肺癌时期的血小板凝聚功能、下调EGFR-STAT3信号通路以及抑制肿瘤生长等方面均具有一定的效用,可在一定程度上提升治疗效果。