羊口疮病毒 F1L基因真核表达载体的构建及鉴定

蒋 尊, 安红艳, 孙创奇, 葛佳仪, 梁 倩, 鲜思美,2

(1. 贵州大学动物科学学院,贵州 贵阳 550025;2. 贵州省动物疫病研究所,贵州 贵阳 550025)

羊口疮又称羊传染性脓疱(Contagious ecthyma,CE),是由羊口疮病毒(Orfvirus,ORFV)引起的急性、嗜上皮性、高度接触性人兽共患传染病,主要感染山羊和绵羊, 临床主要表现为增生性炎症,舌、鼻、口、唇等部位出现水疱、脓疱、丘疹、结痂[1～4]。该病发病率高,病死率低,分布广泛,给养羊业带来严重经济损失,同时也威胁人类健康。 ORFV是痘病毒科、副痘病毒属的线性双链DNA病毒,基因组全长134～139 kb,高度保守基因88个,大部分可变区位于基因组末端,中央核心区基因相对保守[5]。F1L基因位于病毒基因组的中央高度保守区,编码大小约39 ku的F1L蛋白;F1L蛋白为单克隆抗体的主要结合位点,可诱导机体产生中和抗体,具有肝素受体结合活性,可促进动物细胞膜与病毒外膜的融合,与病毒的吸附、成熟及发病机理相关[6]。本研究以ORFV-DZ分离株基因组为模板,扩增其F1L基因,构建真核表达载体,为羊口疮病毒的致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

病毒基因组DNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司),EcoR Ⅰ、XhoⅠ 限制性内切酶(购自TaKaRa公司),质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程股份有限公司),PCR Master Mix (2×)、大肠杆菌DH5α感受态细胞、PageRuler Prestained Protein Ladder(购自Thermo Fisher公司),NeofectTMDNA transfection reagent(购自北京码因科技有限公司),RIPA高效组织细胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂(购自Solarbio公司),pEGFP-N1质粒、ORFV-DZ毒株、HEK-293t(人胚肾细胞)、F1L-B2L融合蛋白多抗(由贵州大学预防兽医学实验室提供)。

1.2 主要仪器

PCR仪(型号:9902,Applied Biosystems公司)、核酸电泳仪(型号:BG-POWER 300,BAYGENE公司)、凝胶成像仪(型号:SYDDR4/2752,SYNGENE公司)、倒置荧光显微镜(型号:IX73,OLYMPUS公司)。

1.3 引物的设计与合成

以GenBank中ORFV标准株(登录号:HQ197753.1)的F1L基因为参考序列,使用Oligo 7.0软件设计1对用于F1L基因的特异引物。F1L-F:5’-CCCTCGAGATGGATCCACCCGAAATCAC-3’(下划线为XhoⅠ酶切位点);F1L-R:5’-CGGAATTCGCACAATGGCCGTGAC-3’(下划线为EcoRⅠ酶切位点),Tm值59 ℃,预扩增片段1 029 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 F1L基因的PCR扩增

按照病毒基因组DNA提取试剂盒说明书方法提取ORFV-DZ病毒总DNA,以此为模板进行F1L基因PCR扩增(高保真PCR)。PCR体系20 μL:ddH2O 6 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqPCR Master Mix 10 μL,DNA模板2 μL。扩增程序:98 ℃ 10 s;59 ℃ 5 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min 。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳,按胶回收试剂盒说明书方法纯化回收。

1.5 F1L基因的克隆及筛选

以内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ分别双酶切pEGFP-N1质粒(携带荧光标签)、纯化PCR产物。酶切体系30 μL:XhoⅠ、EcoRⅠ各2 μL,10×K Buffer 3 μL,pEGFP-N1 10 μL(纯化的PCR扩增产物 12 μL),ddH2O 13 μL(ddH2O 11 μL),37 ℃酶切3 h。纯化酶切产物16 ℃连接过夜,连接体系10 μL:酶切pEGFP-N1 1 μL,酶切PCR产物4 μL,SolutionⅠ5 μL。连接产物转化至DH5α感受态细胞,转化方法:感受态细胞(DH5α)50 μL与连接产物10 μL混匀,冰浴30 min,42 ℃热击90 s,冰浴1 min,加入LB液体培养基800 μL,37 ℃振荡培养40～60 min,8 000 r/min离心2 min,留上清液200 μL,涂布于含卡那霉素的LB平板培养基,37 ℃过夜培养,随机挑取3个单菌落接种于LB液体培养基(5 mL),37 ℃ 200 r/min振荡培养12 h,PCR、双酶切筛选阳性重组质粒,送上海生物工程有限公司测序。

1.6 pEGFP-F1L重组质粒的表达

将HEK-293t细胞接种于6孔板中,细胞融合度达80%左右时按照Neofect转染试剂说明书方法,将pEGFP-F1L重组质粒转染至HEK-293t细胞。设置HEK-293t细胞、pEGFP-N1质粒为对照。转染24 h于倒置荧光显微镜下观察。以蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)冰浴裂解30 min,12 000 r/min,4 ℃离心后收集蛋白上清,Western blotting检测融合蛋白的特异表达。

2 结果与分析

2.1 F1L基因PCR

由图1可见:PCR产物长度为1 029 bp,与预期相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1～2:F1L基因

2.2 pEGFP-F1L重组质粒

由图2、图3可见:EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切PCR阳性质粒产生2个条带,分别为4 723 bp的线性pEGFP-N1、1 029 bp的F1L基因条带,与预期相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1～2:F1L基因双酶切产物;3:pEGFP-N1空载体双酶切产物

M:DL 5 000 DNA Marker;1～3:重组质粒pEGFP-F1L双酶切产物

2.3 pEGFP-F1L的细胞转染及表达

由图4可见:pEGFP-N1对照组和pEGFP-F1L转染组可观察到大量绿色荧光斑,而HEK-293t对照组未见荧光。由图5可见:Western Blotting检测到pEGFP-F1L转染组于约65 ku处有1条蛋白条带,与预期相符。

A:HEK-293t对照组;B:pEGFP-N1对照组;C:pEGFP-F1L重组质粒转染组

M:PageRuler Prestained Protein Ladder;1:HEK-293t对照组;2:pEGFP-F1L转染组;3:pEGFP-N1对照组

3 结论

试验构建了真核表达质粒pEGFP-F1L,并成功在HEK-293t细胞中表达。

4 讨论

目前市场上对于ORFV亚单位疫苗的开发大多针对已知的F1L筛管蛋白和B2L囊膜蛋白2种保护性抗原蛋白。其中F1L蛋白参与组成病毒表面微管,可作为抗原蛋白激发机体免疫应答,诱导产生中和抗体,介导机体的细胞免疫和体液免疫[7],具有较大的疫苗开发潜力。F1L蛋白具有肝素结合活性,能结合宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)受体,推测可能参与病毒的吸附、侵入过程[8]。另一方面,F1L基因可通过影响宿主的PI3K-AKt信号通路[9～11],促进ORFV在宿主细胞中的复制增殖,但F1L蛋白是否能直接影响病毒的增殖和复制还需要进一步探究。F1L蛋白虽然是ORFV的独有蛋白,但其他病毒可能存在类似作用的蛋白,比如通过调控宿主细胞周期促进病毒复制,这一假设也需要进一步验证。