河北省廊坊市牛主要病毒性腹泻病原感染状况检测及牛冠状病毒演化分析

2024-03-01李思远付新成袁雪松蔡旭航孙心如谢玲玲李基棕

畜牧兽医学报 2024年2期

李思远,付新成,袁雪松,毛立,蔡旭航,孙心如,黄金,谢玲玲,王府,周华,张琪,李基棕,4*,李彬,4*

(1.西北农林科技大学动物医学院,杨凌 712100;2.江苏省农业科学院兽医研究所,农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室,南京 210014;3.南京农业大学动物医学院,南京 210095;4.江苏大学生命科学学院食品与生物工程学院,镇江 212013;5.河北省廊坊市农业农村局,廊坊 065000;6.贵州省种畜禽种质测定中心,贵阳 550018;7.黔西市动物疫病预防控制中心,黔西 551500)

牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)属于β冠状病毒,在全球范围广泛流行。主要编码5个结构蛋白,血凝素酯酶(hemagglutinin-esterase,HE)、刺突蛋白(spike protein,S)、包膜蛋白(envelope protein,E)、膜蛋白(membrane,M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)。BCoV最初被认为是肠道病毒,可以造成新生犊牛腹泻[1-2]、牛冬季痢疾,但迄今为止,越来越多的临床案例表明该病毒可以从呼吸道检测出并导致各年龄段牛呼吸道症状[3-4],因此BCoV也是呼吸道病原的说法越来越频繁地被提及。BCoV具有很大的跨物种传播潜力,CoV-OC43被认为与BCoV相近,这两种病毒均能以9-O乙酰唾液酸作为糖结合底物[5-6],受人白细胞抗原Ⅰ亚群(human leukocyte antigen,HLA-Ⅰ)影响[5,7-8],所以BCoV常被作于人呼吸道冠状病毒(人冠状病毒OC-43、SARS-CoV2、HKU1)的研究模型。除了感染牛以外,在其他动物(如羊驼、羊、长颈鹿等)中也检出类BCoV,其中更包括了德国的人呼吸道株4403[9-12],具有溢出跨宿主传播风险。

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)是全世界牛常见的疾病之一。BVDV可以导致牛生育能力下降、产奶量下降、呼吸道症状、腹泻、流产和产死胎等生殖功能异常[13-14]。在亚洲不同国家报道中,牛星状病毒(bovine astroviruses, BoAstV)被证明与牛腹泻有关,但报道的发病率不一致[15-16]。牛轮状病毒(bovine rotavirus virus, BRV)是牛腹泻最常见的原因,能导致显著的并发症和死亡率,在新生犊牛中尤为明显[17-18]。牛环曲病毒(bovine torovirus, BToV)主要引起小牛和成年牛腹泻,还具有双重组织嗜性,可以在呼吸道中检出,并导致牛腹泻,严重患病牛可至死亡[19-21]。牛诺瓦病毒(bovine norovirus, BoNoV)是引起动物胃肠炎的重要病原[22]。嵌杯病毒科的牛纽布病毒(bovine nebovirus, BoNeV)可导致患病牛小肠绒毛萎缩,引起腹泻[22-23]。哺乳动物正呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus, MRV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus, BKoV)也被认为是引起牛腹泻的病原之一[24-25]。

本研究对我国河北省廊坊市以BCoV为主的腹泻病原进行流行病学调查,对BCoV遗传进化分析,为该地这9种病的发病、流行情况及疫病防控提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 样品

从我国河北廊坊地区14个养殖场中采集了323份腹泻奶牛粪样。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒、逆转录酶、Green Taq Mix、2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus) 均购自南京诺唯赞生物科技有限公司,琼脂糖购自北京擎科生物科技有限公司,胶回收试剂盒购自Omega Bio-Tek公司,磷酸盐缓冲液(PBS)购自塞维尔生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

PCR扩增仪和离心机:德国Eppendorf公司;凝胶成像系统:上海天能公司。

1.4 样品处理

将采集的粪样每份转移部分至2 mL离心管中,其余冻存至-80 ℃冰箱。每个EP管中加入1 mL 经高压灭菌的PBS溶液进行震荡充分混匀,离心后弃去沉淀取上清用0.22 mm滤器过滤后流液备用。

1.5 引物合成

参考文献[26-32]合成BCoV、BVDV、BoAstV、BRV、BToV、BNoV、BoNeV、MRV、BKoV相关片段的引物(表1、2)。

表1 病毒性腹泻病原检测引物信息

表2 BCoV S和HE引物信息

1.6 病毒RNA提取及转录

参照说明进行提取总RNA后进行反转录,反转录产物cDNA冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.7 RT-PCR扩增

根据表1检测引物,采用20 μL体系:10 μL Mix,0.4 μL 上游引物F,0.4 μL 下游引物R,1 μLcDNA,8.2 μL ddH2O。使用降落PCR方法扩增片段,反应程序:预变性95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,48～55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共35个循环;彻底延伸72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

根据S和HE特异性引物扩增BCoV阳性样品,采用25 μL体系:12.5 μL Mix,1 μL 上游引物F,1 μL 下游引物R,2 μL cDNA,8.5 μL ddH2O。使用降落PCR方法扩增目的片段,程序为:预变性95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,48～55 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min 共35个循环;彻底延伸72 ℃ 10 min。得到产物使用1%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

1.8 胶回收验证及进化树构建

按胶回收试剂盒说明书回收目的条带胶块,由上海生工生物工程股份有限公司测序,通过测序结果进行序列比对。同时将提取的RNA送上海探普生物公司进行病毒基因组下一代测序。

使用MEGA 11软件进行BCoV的HE、S、N、M、E、ORF1a和全序列基因核酸序列比对,并使用最大似然法构建进化树。

2 结果

2.1 RT-PCR检测

在检测323份样品中BCoV总体阳性检出率为14.24% (46/323),BVDV为1.85% (6/323),BRV为57.89% (187/323),BoAstV为0.31% (1/323),BoNeV为10.84% (35/323),BoNoV为4.33% (14/323),MRV为2.48% (8/323),BToV为4.64% (15/323),BKoV为11.76% (38/323)。该地区BCoV检出率并不高,而BRV高达57.89%,检出率最低的是BoAstV,仅有0.31%。各个牛场不同病原阳性检出率差异较大,BVDV检出率为0.00%～17.65%,BRV检出率为0.00%～100%,BCoV 检出率为0.00%～45.45%,BKoV检出率为0.00%～42.47%,BNeV检出率为0.00%～62.50%,BNoV检出率为0.00%～30.00%,BToV检出率为0.00%～13.33%,MRV检出率为0.00%～11.76%,BoAstV检出率为0.00%～3.33%。其中BRV在每个牛场中均能检出,在7个奶牛场中检出率为100.00%。而BCoV也在12个奶牛场中检出,仅次于BRV。

2.2 混合感染检测

总共有22种混合感染类型,最多同时感染5种病毒。以BRV和BoNeV混合感染检出率最高,高达28.95% (22/76),BCoV混合感染比率为 36.84%(28/76) (表3)。

表3 混合感染状况分析结果

2.3 BCoV的HE和S基因序列扩增

阳性样本采用特异性引物扩增HE和S片段,可分段扩增出1株HE和S全长序列,命名为HBLF2302株(图1)。

M.DL2000 DNA 相对分子质量标准; 1. HBLF2302检测片段;2. HA;3. HB;4. HE;5. S1;6. 35;7. 3536;8. 36;9. 3637;10. S2;11. S3;12. DL5000 DNA 相对分子质量标准M.DL2000 DNA maker; 1. HBLF2302 detected segment;2. HA;3. HB;4. HE;5. S1;6. 35;7. 3536;8. 36;9. 3637;10. S2;11. S3;12. DL5000 DNA maker

2.4 BCoV结构蛋白遗传进化分析

根据NCBI数据库及DNAstar 7.0中的Megalign比对,HBLF2302S基因与我国华东地区MZ711 357.1株相似性最高,达到99.5%。HBLF2302HE基因,与我国西南地区获得的MN982 191.1序列相似性最高,可达99.53%,序列中无12个碱基插入。HBLF2302E、M、N基因与我国其它地区测得的序列相似性均在99.7%以上,差异较小。

从NCBI数据库获得的部分序列S序列进行比对,S进化树结果表明HBLF2302属于GⅡb基因型,为国内BCoV流行的基因型,值得注意的是,HY24株为我国牦牛源毒株,p95为我国台湾省于HRT-18细胞上测得,属于GⅠa基因型。不仅如此BCoV-GX-NN190313和BJ232犬冠状病毒处于独立分支,提示国内BCoV可能存在新基因型。韩国流行株主要以GⅡa基因型为主,但也出现有GⅡb基因型。表明不同基因型跨地区传播的风险在增加。可能存在新基因型的出现,有待进一步测序验证。HE、E、M和N基因在不同基因型中未见有明显分化,表明在不同基因型中除了S差异较大具有分型价值外,其余四个结构蛋白可能不可作为分型依据。

2.5 BCoV S蛋白三级结构分析

通过SWISS-MODEL同源建模及PyMDL分析,发现氨基酸157号区别于其他参考序列157V和157I,854I较为少见,318号位为独特突变位点,在HBLF2302株中处于选择。其中157 T和318V位于S1,854I位于S2。318号位点在HBLF2302上由318I突变为318V时,与631C形成氢键(图2)。

A. 318I局部结构;B. 318V局部结构A. Local structure of 318I of S; B. Local stucture of 318V of S

2.6 BCoV ORF1a序列及分析

通过氨基酸比对结果表明,在目前上传至NCBI中的BCoV中国株的开放阅读框1a(Open reading frame ORF1a)基因中834、857和889号位为区别于其它地区的GⅡb株独特的位点。在其他序列中834W、857 L和889R号位均为一致,而在中国株中834W为834R,857 L为857 S,而在889R为终止密码子(图3)。从遗传进化树上可以看出,除了牦牛源MH810 163.1 HY24仍与GⅠa型传统株处于同一分支外,中国株独立于同为GⅡb型的日本株和美洲株独立成簇(图4)。由此可见,在ORF1a上,同一基因型的BCoV毒株存在一定差异性,并且中国株呈现出独特特征。

图3 ORF1a 834、857和889号位氨基酸序列比对结果Fig.3 Amino acid sequence alignment of ORF1a 834, 857 and 889

图4 基于BCoV ORF1a的进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis based on ORF1a of BCoV

2.7 BCoV 全基因遗传进化分析

根据同源性分析结果,HBLF2302与从内蒙古地区获得的序列OP924 545.1相似性最高,在进化树上也与OP924 545.1进化距离接近。全基因组序列FJ938 067.1 4408株与基于S基因的进化树具有差异,在基于S基因进化树中与GⅠb基因型归为一簇,而在全基因组序列中与GⅠa基因型归为一簇(图5)。

图5 基于全基因组的BCoV遗传演化分析Fig.5 Genetic evolution analysis of BCoV based on whole genome

3 讨论

牛群腹泻的病原多样,呈现出多重病原混合感染的复杂情况,在临床中难以证实某种病原与腹泻的直接相关性。本研究表明,廊坊地区BCoV检出率为14.24%,其他9种腹泻病原的检出率为0.52%～57.89%。混合感染情况占35.37%。近年来,BCoV流行率有着上升趋势,不同地区流行率各有差异,可能存在地方性流行的特点[33-34]。在吉林部分地区报道牛冠状病毒阳性检出率为21.10%[31],云南部分地区为14.29%[32],在北疆地区检出率为0%～38.89%[33],在四川部分地区为16.80%[34],而在高原地区,腹泻牛样本检出率高达69.05%,患呼吸道疾病的牛群中检出率为72.45%[35]。由此可见,在不同地区不同样本牛冠状病毒发病率存在差异,且在腹泻牛群中检出率较高。不仅如此,在国外报道中,巴西为68.7%[36],日本为57.7%[37],韩国为39.8%[38],土耳其为21.9%[39],伊朗为7.2%[40],在不同国家腹泻牛群中检出率也有所差异。本文中均为腹泻样本,牛冠状病毒的检出率为14.24%,可能是由于存在多种病原微生物混合感染,非单一因素或病原引起的牛群腹泻或存在地区流行趋势,因此无法确切表明,牛冠状病毒与腹泻具有直接关联。

按照目前BCoV的基因型划分,不同地区存在着不同基因型的BCoV,美洲、东南亚和东亚流行株(除韩国外)主要为GⅡb,韩国主要为GⅡa,欧洲主要为GⅠb。此外还存少数以经典株为主的为GⅠa和GⅡc基因型。但由于对牛冠状病毒基因型划分依据仍不统一,按目前划分S基因与全基因序列存在差异。更值得注意的是BCoV全基因组序列差异和变异较小,不同地区流行的BCoV基因型主要可能是由贸易原因为主导,因此即使在地处亚洲的土耳其,在S基因上趋向于欧洲的GⅠb基因型。

不仅如此,关键的蛋白的突变和重组可能导致BCoV的易感性增加。S中的S1具有双受体结合基序[37],S1的N端结构域与9-O乙酰唾液酸结合[6],S1的受体结合结构域(receptor-binding domain,RBD)被认为与受体结合,并且大量选择位点位于RBD处,可能改变其宿主谱进而导致溢出。本研究获取S基因的157号位点发生突变,该突变区别于157V和157I,318V为独特突变位点,位于S的NTD端,318号位点的突变改变了侧链残基间相互作用力,是否改变糖嗜性仍需进一步研究。除此之外,本文通过序列比对,发现在参考序列的中国株及HBLF2302株中的ORF1a上的834、857及889 aa存在独特突变位点,区别于其他地区的GⅡb基因型毒株并在889号位点出现终止密码子,是否在后续报道毒株中存在普遍性用于更加细化解析牛冠状病毒,仍需要大量测得序列来验证,并进一步分析。

本研究对中国河北地区牛冠状病毒及其他病毒性腹泻病原进行了流行病学调查,丰富了牛冠状病毒及其他常见病毒性腹泻病原的流调数据,为进一步研究牛冠状病毒及牛腹泻性病原提供了数据。