烫疗药提取工艺及质量标准提升研究*

陈 锋，黄 蓓，韦金彩，莫海涛，覃 翔，梁国成

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.广西子持医药科技有限公司，广西 南宁 530219）

烫疗药是根据我院全国名老中医药专家第二批带徒导师李桂文教授集多年临床经验自拟的验方，制备的外用制剂（注册批准文号：桂药制Z01060103）。该制剂处方由续断、宽筋藤、大黄、姜黄、防风、大驳骨、苏木、桂枝、川乌、草乌、大罗伞、小罗伞、骨碎补、艾叶、泽兰15味壮瑶药、中药组成，具有活血祛瘀、解痉止痛之功效，临床用于治疗风湿骨痛、坐骨神经痛、跌打肿痛、腰及颈椎骨质增生引起的疼痛已有三十余年的历史[1-4]。因烫疗药原生产工艺未进行浸渍提取工艺的系统研究，且原质量标准较为简单，没有定性、定量检测项。为提升烫疗药的有效性、实用性、安全性、稳定性，本研究将在烫疗药的生产工艺和质量提升等方面开展研究，优选出烫疗药最佳浸渍提取工艺并增加烫疗药中主要有效成分的定性及定量检测项。

1 材料

1.1 仪器 2695型高效液相色谱仪，配备Waters-2489紫外检测器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多公司）；TH-Ⅱ型数控薄层色谱加热器（上海科哲科技有限公司）；WFH-205B可见透射紫外反射仪（上海精科实业有限公司）。

1.2 药品与试剂 烫疗药（批号：20210729，20210909，20211122，20220215，20220428，202206401，202206402）由广西中医药大学附属瑞康医院自制；川续断皂苷Ⅵ对照品（批号：111685-201707，含量为90.9%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号：111523-201811，含量为97.4%）、大黄酸对照品（批号：110757-201607，含量为99.3%）、姜黄素对照品（批号：110823-201706，含量为98.7%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 川续断皂苷Ⅵ含量测定

2.1.1 色谱条件 使用2695型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（27.3∶72.7），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为212 nm[5-7]，进样量为10 μL。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 对照品溶液的制备 取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，加甲醇配制成每1 mL含川续断皂苷Ⅵ77.2286 μg的溶液，即得。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 取1袋烫疗药，置90 ℃干燥5 h后粉碎过三号筛，取过筛后的供试品约0.2 g，精密称定，置回流用三角锥形瓶中，精密移取50%乙醇25 mL进锥形瓶，加塞，称定质量，加热回流30 min，加塞后放冷至室温，再称定质量，减失的质量加50%乙醇补足，摇匀，用滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2.3 阴性对照溶液的制备 按“2.1.2.2”项下方法取缺续断的阴性样品制备阴性对照溶液。

2.1.3 专属性试验 吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。结果供试品中川续断皂苷Ⅵ色谱峰与川续断皂苷Ⅵ对照品色谱峰中保留时间一致，并与其他共存成分分离度大于1.5，达到基线分离。阴性对照溶液在川续断皂苷Ⅵ色谱峰相应位置上无干扰峰出现。（见图1）

图1 HPLC 图

2.1.4 线性关系考察 按“2.1.2.1”项下对照品溶液制备方法制备25 mL质量浓度为386.1432 μg/mL的川续断皂苷Ⅵ对照品溶液，分别精密吸取1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，置5个10 mL容量瓶中，加甲醇至10 mL，摇匀。1.0 mL的对照品稀释液进样5、10 μL，其余稀释液各进样10 μL，测定，计算，得回归方程为：Y=2131.00X-247.77（r=0.9999）。表明川续断皂苷Ⅵ在19.30715～154.45720 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取川续断皂苷Ⅵ对照品溶液和供试品溶液连续进样6次测定，结果对照品溶液峰面积的RSD为1.10%，供试品溶液峰面积的RSD为0.84%，表明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定峰面积值，结果供试品溶液峰面积的RSD为1.18%，表明供试品溶液在室温放置10 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 取同一批号烫疗药（批号：20210729），按“2.1.2.2”项下方法称取供试品6份，每份0.2 g，制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算川续断皂苷Ⅵ含量，结果测得川续断皂苷Ⅵ含量平均值为10.147 mg/g，RSD为0.84%，表明方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已测知川续断皂苷Ⅵ含量的供试品0.06 g（批号：20210729）6份，分别加入1.6 mL质量浓度为386.1432 μg/mL 川续断皂苷Ⅵ对照品溶液，按“2.1.2.2”项下供试品制备方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，计算，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.2 浸渍提取工艺正交试验设计 选取烫疗药浸渍提取过程中对浸提结果影响较大的浸渍溶剂浓度（A）、原料粉碎度（B）、浸渍温度（C）、浸渍时间（D）4个因素按L9（34）设计行正交试验，对浸渍提取工艺进行优化，因素水平见表2。

表2 烫疗药浸渍提取工艺水平因素表

2.3 醇溶性浸出物测定 按2020年版《中华人民共和国药典》四部通则2201“醇溶性浸出物测定法”项下的热浸法测定[8]，以50%乙醇为溶剂，测定正交试验中9份不同样品醇溶性浸出物。

2.4 正交试验结果及分析 浸渍提取工艺正交试验以烫疗药的川续断皂苷Ⅵ含量及烫疗药醇溶性浸出物作为评价指标，对试验结果进行分析比较，确定最佳浸渍提取工艺。正交试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 L9（34）正交试验设计与结果

表4 方差分析结果

从表3可知所考察的4个因素中，对浸渍提取工艺的影响大小依次为B＞A＞D＞C。最佳提取工艺为B1A2D3C2，即原料粉碎成细粉碎度，浸渍溶剂为50%乙醇，浸渍时间为10 d，浸渍温度为30 ℃。从表4可知物料粉碎度、浸渍溶剂浓度对烫疗药的浸渍提取工艺影响组间差异有统计学意义（P＜0.05），渍浸时间、渍浸温度对烫疗药的浸渍提取工艺影响组间差异无统计学意义（P＞0.05），且浸渍5 d与浸渍10 d的差别不大，浸渍温度对浸渍提取工艺影响不大，故从生产成本及实际操作性考虑，最终选择浸渍提取工艺为原料饮片粉碎成细粉碎度，浸渍溶剂乙醇浓度为50%，浸渍时间为5 d，浸渍温度为室温。

2.5 浸渍工艺验证 取同一批饮片按优选的浸渍工艺制备3批中试样品，并测定川续断皂苷Ⅵ含量及醇溶性浸出物，结果见表5。

表5 验证结果

2.6 防风的薄层色谱鉴别

2.6.1 供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液制备 取烫疗药5 g，加50%乙醇30 mL，超声提取30 min，滤过，滤液水浴挥去乙醇，残渣加水20 mL溶解，以15 mL水饱和正丁醇萃取，萃取2次后正丁醇液用氨试液洗涤2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。同法用缺防风的阴性样品制备阴性对照溶液。另取5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液。

2.6.2 薄层色谱条件及结果 取5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液2 μL，供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（4∶1）展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃下加热约5 min，置365 nm紫外光灯下检视。结果显示供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照未见相应荧光斑点。（见图2）

图2 防风薄层色谱图

2.7 大黄的薄层色谱鉴别

2.7.1 供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液制备 取烫疗药5 g，加50%乙醇20 mL浸渍1 h，滤过，滤液水浴中挥去乙醇，加水10 mL使溶解，再加1 mL盐酸，水浴加热30 min，冷却后用40 mL乙醚分2次提取，蒸干乙醚液，加入0.5 mL氯仿溶解残渣，作为供试品溶液。同法用缺大黄的阴性样品制备阴性对照溶液。取大黄酸对照品，用甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为大黄酸对照品溶液。

2.7.2 薄层色谱条件及结果 吸取上述3种溶液各4 μL，点于同一硅胶H薄层板上，用石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液展开，置365 nm紫外光灯下检视。结果显示供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光主斑点；置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色，阴性对照未见相应斑点。（见图3）

图3 大黄薄层色谱图

2.8 姜黄的薄层色谱鉴别

2.8.1 供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液制备 取烫疗药5 g，加50%乙醇20 mL，振摇提取30 min，滤过，滤液蒸干，加1 mL无水乙醇溶解残渣，作为供试品溶液。同法用缺姜黄的阴性样品制备阴性对照品溶液。另取姜黄素对照品，加无水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为姜黄素对照品溶液。

2.8.2 薄层色谱条件及结果 吸取供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，姜黄素对照品溶液2 μL，点于硅胶G薄层板上，用三氯甲烷-甲醇-甲酸（96.0∶4.0∶0.7）展开，365 nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照在相应位置上未见相同的斑点。（见图4）

图4 姜黄薄层色谱图

2.9 烫疗药样品的含量测定 取按正交试验得出的最佳浸渍工艺生产的烫疗药6批，每批2袋，按“2.1.2.2”方法制备供试品溶液，按“2.1.1”条件进行测定，计算川续断皂苷Ⅵ含量。（见表6）

表6 样品中川续断皂苷Ⅵ含量测定结果

3 讨论

烫疗药处方中续断为主药，有补肝肾、继筋骨的功效，临床用于肝肾不足、腰膝酸软、风湿痹痛、跌打损伤、筋伤骨折等，具镇痛抗炎、止血、促进骨组织再生等药理作用[9-10]。续断中有效成分为续断皂苷Ⅵ[11-12]。烫疗药的提取工艺为醇浸渍提取，使用方法为将烫疗药加入药酒加热后敷于患处。烫疗药属于典型传统中药外治的热熨剂。川续断皂苷Ⅵ是其主要成分之一，其余大部分成分为醇溶性成分，故本研究采用正交试验法，以烫疗药醇溶性浸出物及烫疗药的川续断皂苷Ⅵ含量作为综合评价指标，对烫疗药的浸渍提取工艺进行优选。川续断皂苷Ⅵ权重系数定为30，醇溶性浸出物权重系数定为70，两者结合比单纯使用某一有效成分或浸出物为单一考察指标更全面、科学。

因烫疗药早期研究已通过单因素试验优选出最佳的药材与浸渍溶剂量比，故本研究在原工艺基础上对浸渍溶剂浓度、浸渍时间、浸渍温度、原料粉碎度进行考察，根据方差分析结果结合医院制剂生产的实际情况最终选择浸渍提取工艺为：物料粉碎成细粉碎度，浸渍溶剂浓度为50%，浸渍时间为5 d，浸渍温度为室温。3批中试放大证明此工艺稳定、可行。

一般供试品的提取方法有超声提取法[13-14]、加热回液法[15-16]、索氏提取法[17]。本研究对这3种提取方法进行了试验对比。结果表明，索氏提取川续断皂苷Ⅵ含量最高，但与加热回流测定结果相差不大，且加热回流法更简便、快捷，故本研究最终采用加热回流法，并在确定提取方法后对提取溶剂、剂量、提取时间分别进行考察比较。结果表明，用25 mL的50%乙醇提取30 min所得川续断皂苷Ⅵ含量最高。

烫疗药供试品前处理[不同干燥温度（70、80、90 ℃）及不同干燥时间（3、5、7 h）]的样品单因素试验考察结果表明，90 ℃干燥温度下干燥5 h的样品川续断皂苷Ⅵ含量最高，故样品前处理干燥温度设定为90 ℃，干燥时间设定为5 h。

6批烫疗药含量测定结果显示，川续断皂苷Ⅵ的含量范围为5.40～8.28 mg/g，产生此差异的主要原因为：6批烫疗药生产投料使用的续断因产地不同，采收时间不同，生产厂家不同，不同批次之间的川续断皂苷Ⅵ含量本身存在有较大的差异[18-20]。

本研究采用TLC和HPLC法对烫疗药进行了质量控制，结果定性鉴别中防风、大黄、姜黄斑点清晰，分离效果好，阴性对照无干扰；川续断皂苷Ⅵ含量测定、线性关系、精密度、稳定性、重复性良好，表明新增的质量控制方法稳定性及重现性良好且专属性强，可作为烫疗药质量标准提升的参考。