苦豆子生物碱对PC12细胞的毒性作用及其机制研究*

罗福祥，阿娜古丽·马合木提，罗静莺，高 莉，闫 明

（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所/新疆维吾尔自治区维吾尔医方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011）

苦豆子是豆科槐属植物苦豆子（Sophora alopecuroides L.）的干燥全草、根及种子，在我国主要分布于新疆、内蒙古、陕西、甘肃等西北地区，被收载于《中华人民共和国药典》《全国中草药汇编》《新疆中草药》《维吾尔药志》等[1]。其味苦，性寒，有毒，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用[2]。现代药理学研究表明，苦豆子具有改善胰岛素抵抗[3]、降血糖[4]、抑菌抗炎等作用[5-6]。也有研究表明，苦豆子对肝肾及神经细胞具有一定的毒性作用，其毒性反应的主要化学成分为生物碱类[7-9]。目前，苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱已应用于临床治疗各种疾病，如以苦参碱为原料用于治疗妇科霉菌性炎症及宫颈糜烂，苦豆子总碱直肠栓用于治疗慢性前列腺炎等。因此，临床应注意监测苦豆子生物碱的用药安全性。为了解不同苦豆子生物碱对神经细胞毒性的强弱及作用机制，本实验通过从苦豆子中分离常见用于临床的苦豆子生物碱分别作用于PC12细胞，从毒性扰动通路角度探讨苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对神经细胞的细胞毒性及其作用机制，旨在为临床用药的监测提供依据。

1 材料

1.1 仪器 YJ-875型生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；37XB型倒置显微镜（上海光学六厂）；MCO-18AIC型CO2培养箱（日本Sanyo公司）；MμLtiskanGo 1510酶标仪（美国Thermo 公司）；FC 500流式细胞仪（美国Becakman CoμLter公司）；LDZM-80KCS型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）；垂直电泳槽（美国BIO-Rad公司）；转移电泳槽（美国BIO-Rad公司）；UVP凝胶图像分析仪（美国UVP公司）；SQP型电子分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药物与试剂 苦豆子总碱（总碱含量为82.7%）购自西安立森生物科技有限公司；苦参碱（含量>98%）购自西安玉泉生物科技有限公司；槐定碱（含量>98%）购自西安玉泉生物科技有限公司；RPMI-1640培养基（批号：1645374）购自美国Gibco公司；胎牛血清（NZJ1221）购自美国Thermo公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit l（批号：5043815）购自美国BD Biosciences公司；PI/RNase Staining Buffer（批号：6051571)购自美国BD Biosciences公司；神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE，批号：ab79757）购自Abcam公司；过氧化物酶体增殖物激活受体r辅激活因子-1α（PGC-1α，批号：ab54481）购自Abcam公司；核因子E2相关因子（nuclear factor E2 related factor，Nrf 2，批号：ab92946）购自Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武汉博士德生物，批号：BST17C18B17E54）；GAPDH（美国Proteintech，批号：10494-1-AP）。

1.3 细胞 PC12细胞（大鼠嗜铬细胞瘤），购自中国科学院上海细胞库。

2 实验方法

2.1 细胞培养 PC12细胞使用含10% FBS的RPMI 1640培养液（含10% FBS和1%青霉素/链霉素），置于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养，细胞融合达80%时，常规消化、离心、传代。

2.2 MTT法检测苦豆子碱对PC12细胞增的殖抑制作用 收集生长对数期PC12细胞，常规消化，离心，计数，调整细胞浓度为5×104个/mL接种于96孔板中，每孔加入细胞混悬液100 μL，设置对照组，边缘孔填充150 μL无菌PBS，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。24 h后分别取苦豆子总碱、槐定碱、苦参碱溶于细胞培养液中，逐级稀释为2.0000、1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625 mg/mL等6个浓度。弃去96孔板中原有培养液，各给药组每孔分别加入100 μL相应药物浓度的培养液，对照组加入等体积培养液，每组设8个复孔，继续培养24 h。培养结束后，荧光倒置显微镜下观察、拍照，采用MTT法，于酶标仪490 nm处测定吸收值（OD），实验重复3次，计算细胞增殖抑制率，抑制率（%）=1-（加药组OD/空白组OD）×100%。IC50采用Graphpad Prism 5软件提供IC50的计算模型计算。

2.3 流式细胞术检测苦豆子生物碱对PC12细胞凋亡的影响 取对数生长期PC12细胞，常规消化，离心，调整细胞浓度为5×104个/mL接种于25 cm2细胞培瓶中，5 mL/瓶，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。培养24 h后弃去培养液，依次加入相应药物终浓度为0.5、1.0、2.0 mg/mL的含药培养液，4 mL/瓶，设置对照组，继续培养24 h。培养结束后分别收集各组细胞于离心管中，1000 r/min，离心10 min后弃去上清液，加入1 mL预冷的PBS重悬细胞后再次离心，重复清洗3次。1X Binding Buffer重悬细胞，并调整细胞浓度为1×106个/mL，取100 μL细胞悬液至5 mL流式细胞管内，每组重复3管，各管分别加入5 μL FITC和5 μL PI，轻轻混匀，避光至于25 ℃温浴15 min。各管加入400 μL 1X Binding Buffer后过200目尼龙滤网，上流式细胞仪进行检测，并计算凋亡率。

2.4 Western blotting法检测苦豆子生物碱对相关蛋白表达水平的影响 PC12细胞的培养、药物作用及细胞收集同“2.3”项。收集各组细胞加入裂解液充分裂解，4 ℃离心15 min（8000 r/min，离心半径为10 cm）取上清，经BCA法定量蛋白。取各组蛋白40 μg，与4倍体积SDS-PAGE缓冲液混匀，水浴沸腾5 min。上样电泳分离，跑胶后转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入NCE、Nrf 2、PGC-1α一抗（1∶1000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，加入相应二抗（1∶2000），室温下孵育1 h洗膜。对胶片进行扫描分析，GAPDH为内参，以目的蛋白灰度值与内参灰度值比值来表示蛋白表达的水平，实验重复3次。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD（方差齐）或Tamhane’s T2（方差不齐）检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 苦豆子总碱、槐定碱、苦参碱对PC12细胞增殖的抑制作用 与对照组比较，苦豆子总碱、槐定碱、苦参碱对PC12细胞的增殖均有一定的抑制作用，随着苦豆子总碱、槐定碱、苦参碱给药浓度的增加，3种苦豆子生物碱对PC12细胞的增殖抑制率均显著升高（P＜0.01），抑制率同药物浓度成一定的依赖关系。其中，苦豆子总碱对PC12细胞增殖的抑制作用最为显著，差异有统计学意义（P＜0.01）。各苦豆子生物碱IC50分别为0.104、19.971、6.040。苦豆子总碱、槐定碱、苦参碱在0.50 mg/mL以上时，对PC12细胞的抑制率均较高，且存在一定的浓度依赖性，因此选取药物活性最强的0.5、1.0、2.0 mg/mL作为后续实验浓度，比较同浓度水平时药物对PC12细胞各项指标的影响。（见表1）

表1 苦豆子总碱、槐定碱、苦参碱对PC12 细胞增殖的抑制作用 （±s，n=8）

表1 苦豆子总碱、槐定碱、苦参碱对PC12 细胞增殖的抑制作用 （±s，n=8）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与同浓度苦豆子总碱比较，bP＜0.05。

浓度/（mg/mL） 苦豆子总碱抑制率/% 槐定碱抑制率/% 苦参碱抑制率/%对照组0.00±0.090.00±0.040.00±0.072.000068.09±0.02a30.44±0.03a b25.70±0.07a b 1.000068.05±0.05a28.16±0.03a b25.71±0.07a b 0.500073.16±0.08a20.30±0.01a b18.49±0.03a b 0.250069.24±0.10a18.10±0.05a b10.45±0.09a b 0.125049.76±0.09a14.99±0.01a b3.45±0.05b 0.062536.22±0.05a11.95±0.03a b4.68±0.06b IC500.10419.9716.040

3.2 苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对PC12细胞凋亡作用的影响 与对照组比较，随着各给药组浓度的增加，早期凋亡率均显著升高，其中浓度为2.0 mg/mL时苦参碱早期凋亡率最高（P＜0.01）；苦参碱、槐定碱各浓度晚期凋亡率均显著升高（P＜0.01），当浓度为2.0 mg/mL时，苦豆子总碱晚期凋亡率最高（P＜0.01）；与早期凋亡的细胞比较，各组细胞的凋亡基本发生在晚期，当各组药物浓度为2.0 mg/mL时，苦豆子总碱组总凋亡率最高（P＜0.01）。（见表2、图1）

图1 苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对PC12 细胞凋亡的影响流式结果图

表2 苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对PC12 细胞凋亡的影响（±s，n=6）

表2 苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对PC12 细胞凋亡的影响（±s，n=6）

注：与对照组比较，aP＜0.01；当药物浓度均为2 mg/mL时，与苦豆子总碱组比较，bP＜0.01。

组别浓度/（mg/mL）早期凋亡率/% 晚期凋亡率/% 总凋亡率/%对照组-1.77±0.3115.00±1.0016.80±0.79苦豆子总碱0.58.53±0.65a 15.13±0.7523.67±1.24a 1.013.03±0.45a 14.20±0.6127.23±0.25a 2.018.40±0.70a 61.70±0.46a 80.10±0.53a苦参碱0.57.07±0.71a 12.67±0.51a 19.73±1.16a 1.07.70±0.66a 24.07±0.60a 31.77±0.75a 2.032.83±0.75a 36.03±0.75a 68.87±1.50ab槐定碱0.54.77±0.55a 11.90±0.82a 16.67±1.361.04.20±0.36a 19.10±0.35a 23.30±0.70a 2.019.97±0.76a 30.07±0.57a 50.03±1.00ab

3.3 苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对PC12细胞相关蛋白表达水平的影响 与对照组比较，随着苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱浓度的增加，NSE的表达显著减弱（P＜0.05或P＜0.01）；而PGC-1α、Nrf 2的表达显著增强（P＜0.05或P＜0.01）。（见图2～4）

图2 苦豆子总碱对PC12 细胞相关蛋白表达水平的影响

图3 苦参碱对PC12 细胞相关蛋白表达水平的影响

图4 槐定碱对PC12 细胞相关蛋白表达水平的影响

4 讨论

苦豆子中含有多种生物碱，在发挥药效的同时，也具有一定的毒性作用，其毒性主要作用于肝、肾及中枢神经系统和心血管系统[10]。过量的苦豆子生物碱会使肝细胞的增殖受到一定抑制，使细胞中线粒体发生变化，从而诱导细胞凋亡，也可促进中枢神经过度兴奋，导致癫痫样惊厥发作，呼吸麻痹等[9,11]。因此，研究苦豆子生物碱的毒性对指导临床安全用药具有重要的意义。

NSE是神经元和神经内分泌细胞特有的一种酸性蛋白酶，只存在于神经元细胞质中。正常的神经元细胞质中NSE的含量较高，当神经元细胞受损后，神经元细胞膜的完整性受到破坏，NSE从神经元细胞质中流向细胞外[12]。因此，NSE是脑损伤患者临床监测的一项重要指标，对脑缺血损伤的整个动态变化过程及预后有重大意义[13-14]。经苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱分别作用于PC12细胞后，各给药组细胞的增殖均受到不同程度的抑制，细胞凋亡率显著升高，PC12细胞中NSE表达水平均显著降低。实验结果提示，在体外细胞实验中，苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱均可显著增加PC12细胞的损害，具有明显的细胞毒性作用，其中苦豆子总碱对PC12细胞的细胞毒性作用最为显著。

PGC-1α和Nrf 2通路在化合物诱导的线粒体损伤中发挥着重要调控作用，是与线粒体功能密切相关的两条蛋白通路[15-16]。其中，PGC-1α是维持线粒体生物合成和能量代谢的主要调节因子。研究结果表明，PGC-1α的上调能够促进线粒体生物合成，调控线粒体数量，改善线粒体功能，增强不同组织细胞的有氧呼吸功能，且在能量平衡、线粒体氧化代谢、热量控制及糖、脂代谢等方面发挥着重要的作用[17-19]，对氧化应激和细胞损伤具有神经保护作用[20]。Nrf 2是一种重要的氧化还原敏感性转录因子，隶属于亮氨酸拉链蛋白家族[21]，在维持细胞稳态、调节细胞能量代谢以及凋亡和自噬等反应中发挥着重要作用[22-23]。此类蛋白具有强大的调节抗氧化蛋白表达的作用，有利于改善机体氧化应激状态，促进细胞存活以及维持细胞的氧化还原稳态，从而调节细胞的氧化应激等[24-25]。当苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱分别处理PC12细胞后，各给药组PGC-1α及Nrf 2蛋白表达水平均显著升高，实验结果提示PC12细胞发生了氧化应激反应，Nrf 2信号通路参与了细胞的抗氧化过程。而PGC-1α表达水平的升高可能原因为Nrf 2蛋白表达水平的异常升高，细胞通过上调PGC-1α的表达进而对氧化应激和细胞损伤具起到保护作用，但具体原因还需进一步深入探究。

综上所述，PC12细胞受到氧化应激性损伤，通过扰动Nrf 2信号通路诱导PC12细胞发生凋亡，是苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对PC12细胞产生毒性的原因之一。