基于微纳米技术的细胞内递送的物理方法

袁子群，毛志宇，高兴华，胡国辉，巫金波，张萌颖†

①上海大学 理学院，上海 200444；②上海大学 材料基因组工程研究院，上海 200444；③上海大学 力学与工程科学学院，上海 200444

21世纪以来，外源性物质的细胞内递送已经成为进行基因治疗、基因重编辑、再生医学以及生物分析等现代生物科学研究的必要条件。然而，细胞膜作为天然的生物屏障，严格阻止生物大分子进入细胞，导致向细胞内递送药物或分子的效率较低。为了克服这一难题，近年来出现了多种细胞内药物或分子递送的方法，包括基于载体的生物方法和基于膜破坏的物理方法。前者由病毒[1-2]或化学药物[3-4]介导，然后通过细胞内吞或融合作用内化递送物质。虽然这类方法已被证明对基因转移和治疗有效，但往往是针对特定细胞类型的，并且常常受到细胞毒性和不必要的免疫、炎症反应的影响，导致细胞存活率降低[5-7]。而基于膜破坏的物理方法可以绕过内吞作用，通过外力使细胞膜产生短暂的孔隙，在细胞膜重新封闭之前，外源分子经瞬态孔隙迅速扩散进入细胞内部，完成大分子物质的递送。实验证明，通过这类技术转染的细胞产生不良反应和不必要的免疫原性反应的概率非常小，并且可以在高通量下表现出较高的转染效率。近年来，随着微纳米技术的发展，通过物理方法实现胞内递送的研究也得到进一步的突破。本文将概述传统的物理方法(包括电穿孔、声穿孔和微注射等)实现胞内递送的原理与进展，并重点介绍近年来出现的基于细胞挤压实现物质递送的一系列微流控平台的结构与机理。

1 电穿孔

电穿孔技术是利用短高压电脉冲可逆地破坏细胞膜，从而完成大分子物质递送的物理方法，是过去几十年来最常用的基因递送方法之一。这项技术最初是为转基因开发的，后来逐渐应用于向不同类型的细胞递送各种大分子物质。在短时间的高压电脉冲作用下，细胞膜会产生允许分子通过的小孔，当跨膜电位超过一定阈值时，可以实现细胞的物质传递。其跨膜电位描述方程为

式中Vm为跨膜电位，f为细胞外场的形状因子，Eext为外加电场强度，r为细胞半径，Ø为r与Eext的极角[8]。

1982年Neumann等人首次使用电穿孔技术，成功地将DNA递送至小鼠淋巴细胞内[9]，开创了通过施加高强度电场提高细胞内DNA递送效率的简易物理方式。20世纪80年代，体外电穿孔技术广泛应用于物质递送，如将人体κ免疫球蛋白基因递送至小鼠前B淋巴细胞[10]，将质粒DNA、反义RNA递送至植物细胞[11-12]以及将DNA递送至细菌细胞[13-14]等。20世纪90年代开始，体内电穿孔有了广泛应用[15]，在肌肉[16]、皮肤[17]、肝脏[18]以及肿瘤[19-20]组织成功完成细胞内的物质递送。目前，电穿孔技术仍被频繁使用。与20年前的平台相比，现代电穿孔技术提高了递送效率，缩短了操作时间，提高了细胞的存活率和操作精度。2006年Saito通过电穿孔成功完成神经系统的转染[21]，在30 min内完成对10个胚胎的转染且存活率和转染效率均在80%以上。2010年Geng等人开发了一种用于基因传递的流式电穿孔方法[22]，不同于传统电穿孔装置每次只能对体积约1 mL的少量样品进行操作，该方法能以20 mL/min的高通量连续转染中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞，转染效率高达75%。2011年Boukany等人将电穿孔与纳米技术结合起来，引入了一种纳米通道电穿孔技术，可以将精确数量的生物分子递送到活细胞中[23]。该装置包括两个由纳米通道相连的微通道，一边是细胞，另一边是试剂。当在两个微通道之间施加高压脉冲时，细胞膜的有限区域会受到强电场的影响，从而允许精确数量的生物分子进入细胞质。总的来说，电穿孔技术的优势在于可以高效完成基因或其他生物分子的胞内递送，但需要非常复杂的脉冲发生器来产生短高压电脉冲，并且存在对细胞造成永久性损伤的可能性，难以保证稳定的高存活率。

2 声穿孔

声穿孔技术是一种利用超声波促进细胞内给药的方法。高振幅声波诱导的空化被认为是利用声波实现细胞内传递的主要机制，稳定空化和瞬态空化是两种典型的空化形成模式[24]。稳定空化是指被压缩气泡的稳定振荡产生的剪切力破坏细胞膜形成了瞬时孔隙，被递送的基因或药物得以成功进入细胞内部。瞬态空化是指气泡破裂产生的冲击波作用于细胞膜，从而完成基因或药物的递送[25]。声穿孔是可逆的非破坏性过程，细胞膜在超声作用后的几秒钟内就能自我修复。20世纪90年代，声穿孔技术开始应用于细胞的基因递送。Bao等人[26]和Kim等人[27]先后利用声穿孔成功实现了质粒DNA的体外递送。之后，更多研究致力于利用声穿孔进行DNA的体内递送，比如骨骼肌[28]、颈动脉[29]、肾[30-31]和心脏[32]等组织均检验到利用声穿孔成功完成了DNA的转染[33]。此外，超声技术有希望进行癌症或肿瘤的治疗，药物或基因载体可以注射到小鼠体内，脉冲聚焦超声随后应用于肿瘤组织，通过破坏微泡和纳米泡来触发药物释放或改善药物传递[34]。2011年，Yang等人通过声穿孔将载有Fe3O4纳米粒子的微泡释放到肿瘤细胞[35]。使用这种方法，纳米颗粒可以有效且无创地进入肿瘤细胞，并且可以通过调节声波强度来控制递送速率。总之，声穿孔技术可以非破坏性且精准地完成局部给药或基因递送，其劣势在于声波的生成机制较为复杂，影响超声结果的实验参数太多，并且在声穿孔过程中可能会产生复杂的生物效应。

3 微注射

单细胞微注射技术是使用纳米针或纳米线穿透细胞膜，直接将蛋白质等非渗透大分子送入细胞内精确位置的物质递送方式。2007年Chen等人发现通过单根多壁碳纳米管，可以将蛋白质包裹的量子点以纳米级分辨率送入活的人体细胞。这种纳米管不会造成明显的细胞损伤，并且不需要载体溶剂便可将离散的分子递送到细胞内部[36]。2009年Yum等人使用氮化硼纳米管将荧光量子点送入活细胞[37]，研究证明了单分散量子点会有选择性地进入活细胞的细胞质或细胞核。此后，Singhal等人报道了碳纳米管内窥镜用于微创细胞内探测、药物递送等一系列单细胞操作。这种内窥镜可以以大约100 nm的分辨率在不破坏细胞活性的情况下非常精确地进入细胞的特定区域[38]，还能够以微创的方式将纳米粒子和阿升(1 aL=10-18L)液体运输到精确的位置。纳米针注射具有给药剂量控制精确、转染效率高等优点，已广泛应用于基础研究和临床实践，但是其注射及后续分析仅限于单细胞水平，无法实现自动化高通量的物质递送，这一缺陷严重限制了该技术未来的临床应用。

为了实现高通量细胞内递送，Kim等人首先演示了应用硅纳米线(SiNWs)阵列的直接转染方法[39]。该研究将人类胚胎肾(HEK 293T)细胞在预先涂有DNA的SiNWs上培养(图1(a～b))，实验中观察到细胞可以被SiNWs穿透并实现HEK 293T细胞系的基因转染，但是转染效率低至不足10%。随后Shalek等人证明了SiNWs如何穿透细胞膜，利用细胞可以健康生长在垂直SiNWs上将表面结合的外源性分子直接释放到细胞质中[40]。因为SiNWs上可以同时培养大量的细胞，所以该平台可以在不需要化学修饰或病毒包装的情况下，以高通量的方式将各种生物分子引入活细胞。2012年Melosh等人开发了空心氧化铝纳米管阵列[41]。纳米管可以在细胞培养过程中穿透细胞膜，将蛋白质或遗传分子注入细胞(图1(c～e))。随后，该课题组在电穿孔平台上装备了纳米管阵列。在电穿孔的辅助下，实现了高效的分子递送，转染效率可达80%，并保持90%以上的细胞存活率[42]。2022年Zhang等人对电穿孔纳米管的生物安全性进行研究，综合分析了经历数次纳米管电穿孔后的细胞在增殖基因功能的变化(图1(f～g))。结果表明，反复多次的纳米管电穿孔对细胞没有明显的负面影响，这项工作证明了在细胞上重复进行纳米管电穿孔的可行性[43]。综上可见，纳米管电穿孔是一种很有前途的药物或分子递送方式，但其制备工艺通常需要复杂的纳米制造仪器及较高的操作要求，难以应用于大规模自动化的细胞内药物或分子递送。

图1 微纳米线/管阵列装置：(a～b)小鼠胚胎干细胞(mES)被硅纳米线穿透的SEM图像与共聚焦显微镜图像；(c～e)通过纳米管阵列实现生物分子胞内递送的典型设备的截面图与此平台对CPD细胞转染时的SEM图像(绿色)[41]；(f～g)纳米管电穿孔器件与生物分子递送机理示意图[43]

4 细胞挤压

细胞挤压技术指的是细胞受到外力挤压发生变形时，细胞膜上开启力敏通道，基因或大分子等非渗透性转染的物质通过通道进入细胞内部完成转染的递送方法。该技术控制物质递送的主要参数包括生物分子混合物流动时的压力、流速，无量纲参数(如雷诺数、韦伯数等)以及作用时间等[44-45]。2008年Hallow等人将DU145前列腺癌细胞暴露在流体剪切力下，首次利用细胞挤压的方法成功向细胞内递送了钙黄绿素(0.62 kDa)、牛血清白蛋白(66 kDa)以及大分子量的葡聚糖(150～2 000 kDa)[46]。然而，该研究装置将细胞在较短时间内(如小于1 ms)暴露于一个较大剪切力(如大于2 000 dyne/cm2, 1 dyne=10-5N)下，转染效率不足40%并且仅能维持约80%的存活率，这样的结果证明该方法仍需改进。

2013年Sharei等人对细胞进行物理收缩来打开细胞膜进行物质递送。细胞被驱使注入仅有数微米收缩尺寸的微通道，由于微通道尺寸小于细胞直径，细胞遭受挤压打开细胞膜，从而使外源性物质被动扩散到细胞质中[47]。通道是利用光刻工艺在硅片上制造的，并使用耐热玻璃层进行密封(图2(a))。该装置由45个宽度为48 μm，长度为10～40 μm的平行微通道组成，这有助于研究改变收缩几何形状对传递效率和细胞活力的影响，并行通道也防止了任何一个通道堵塞导致的设备故障。该研究假设当细胞通过一个最小尺寸小于细胞直径的狭窄处时，细胞的快速机械变形会导致短暂的膜破裂并出现孔道，这些孔的大小和频率将是细胞在收缩过程中所经历的剪切力和压缩力的函数，在孔愈合前周围培养基的物质可以直接扩散到细胞质中。实验完成了荧光标记的3 kDa和70 kDa葡聚糖对人包皮成纤维细胞(NuFFs)、小鼠树突状细胞以及胚胎干细胞的转染，流式细胞术显示转染效率达70%，增加收缩通道长度和减小收缩通道宽度都显著提高同一流速时的递送效率。随后该研究测试了通过该平台将不同类型的材料输送到不同类型的细胞中，如将多糖、核酸、碳纳米管等大分子递送至小鼠的免疫细胞(如T细胞、B细胞、巨噬细胞等)[47]。之后，该课题组分析了通过收缩微通道细胞的质膜恢复动力学数据[48]，指出在该收缩通道不牺牲细胞活力的情况下，该技术产生的细胞膜上通道直径可能超过200 nm，且钙离子对细胞膜愈合有着显著影响，无钙环境下膜愈合时间由30 s延长至5 min，提高约5倍的递送效率。2018年Liu等人对细胞挤压过程中细胞内外的体积交换进行分析，对转染前和压缩期间的细胞模型进行模拟与实验发现，当细胞受到压缩力变形时，会导致部分细胞质排出，去除外力后，细胞会吸收周围介质中的细胞外液来恢复自身的大小和形状[49]。实验表明，当细胞受到多次挤压时，增加连续两次挤压之间的缓冲时间可以增强外液吸收和物质递送效果。

图2 微通道实现细胞挤压的装置：(a)通过收缩微通道暂时打开细胞膜的装置与机理示意图；(b)实现细胞挤压的微流控平台、细胞压力模拟与瞬时孔隙生成示意图[47]；(c～d)单变形与双重变形的细胞挤压装置，两种变形通道SEM图、细胞变形示意图，以及该装置对hASCs进行不同分子量FITC-dextran的转染效率受微缩间距的影响[50]

2019年Modaresi等人设计了一种驱使细胞进行双重变形的微流控平台(图2(c～d))，该研究开发的两种微流控装置，一个只允许单一变形，另一个允许双重变形[50]。芯片的主体是基于SU-8软光刻技术的PDMS(聚二甲基硅氧烷)材料，其中每个芯片上有7个分散区和12个挤压区。两种设计的分散区均含有直径20 μm、高15 μm的PDMS柱、彼此之间相隔30 μm的PDMS柱阵列。对于挤压区域，一种是使细胞定向通过20 μm收缩形成的微通道，造成单一变形；另一种通道两侧错落收缩，微缩之间最短间隙为8 μm，造成细胞的双重变形。该研究完成了Dex-FITC对人脂肪来源干细胞(hASCs)的转染实验，结果表明双重变形设计比单一变形显示出更高的递送效率。该平台适用于生物小分子的胞内递送，双重变形的设计在保证较高的细胞活力(>80%)下具有高达85%的递送效率。2021年Han等人优化了微流控平台上微通道设计(图2(b))，在硅片上使用PDMS制作的器件包含14个相同的散射区和变形区，每个变形区内有10行收缩微通道，每个微缩结构在尺寸和形状上都有所不同[51-52]。该研究在实验上成功将单链向导RNA(sgRNAs)和Cas9转染到各种类型的细胞中，未来或成为将CRISPR-Cas9高通量导入细胞的有效工具。

此外，许多研究通过调节细胞与流体在微流体装置内的流动，使单个细胞被拉伸或挤压，流体扩散和对流的结合导致瞬态空隙的产生从而完成物质递送，这种利用流体动力实现细胞挤压的方法也被称为水穿孔。相较于收缩微通道，水穿孔的同一种平台可以适用于不同尺寸形状的细胞，并且已被证明能够以高通量将不同的生物分子递送至各种细胞中。2013年Adamo等人通过发射液体射流将生物分子输送到悬浮细胞中[53]，该装置使用光刻和深反应离子刻蚀(DRIE)制备，包括细胞流经的通道、位于该通道顶部的喷嘴和包含转染生物分子的流体室(图3(a))。当细胞流经微米尺寸的喷嘴下方时，压力脉冲通过压缩压电膜施加到腔室上，将喷射出的少量转染生物分子穿透并递送至细胞中。2018年Deng等人报道了利用通道中流体的惯性流动，使细胞在T形结通道壁碰撞尖锐尖端形成短暂的膜孔，通过被动扩散实现生物分子的递送[54]。芯片采用软光刻技术制造，实验包括三个步骤(图3(b))：①使用注射泵将细胞和转染材料注入通道；②流体的惯性将随机对齐的细胞定位在通道的中线；③流动的细胞在包含尖锐尖端的T形结的通道壁上碰撞。这种细胞壁碰撞加上流体剪切能够引起足够的膜破坏，通过瞬态空隙将转染材料被动扩散至细胞内。通道壁上的尖端的存在确保了高效递送所需的有效应力。该研究使用该装置成功对MDA-MB-231细胞系转染FITC-dextran(葡聚糖)(图3(c～d))，在雷诺数(Re)为325时转染效率达80%，并保持80%以上的细胞活力。随着Re的增加，递送效率提高，细胞活力降低。此外，该装置还可有效递送质粒DNA、CRISPR-Cas9和DNA纳米结构等不同生物分子，并且单通道可达到每分钟106个细胞的吞吐量。2020年Hur等人将该平台进一步优化，通道壁上的尖锐尖端被一个空腔取代，使细胞与液壁而不是PDMS尖端碰撞[55]，这种改进可以有效提高细胞的存活率并减轻了通道堵塞的问题。实验成功向K562细胞内递送3～5 kDa FITC-dextran，在保证细胞存活率在90%以上时，得到高达90%的转染效率。

图3 微流控水穿孔的装置[53]：(a)微流体喷射机理示意图；(b)惯性微流体细胞水孔器(iMCH)进行胞内递送示意图与高速显微镜下的细胞壁碰撞图像；(c)iMCH在不同雷诺数下向MDA-MB-231递送3 kDa FITC-dextran 18 h后的荧光和明场图像；(d)iMCH对MDA-MB-231进行不同分子量FITC-dextran的转染效率与存活率受雷诺数的影响

近年Kizer等人改良了碰撞壁型水孔微流控平台[54]，并开发了一种非碰撞的微流控平台进行水穿孔[56]。该平台将含有细胞与递送物质的混合液从两侧同时注入，在微通道交叉口高速对流，通过对细胞的快速水动力剪切使细胞拉伸从而打开细胞膜上的瞬态孔隙(图4(a～c))。该平台完成外源物质向细胞内递送的方式除了被动扩散，还存在挤压过程中跨细胞膜的快速溶液交换，这种对流的介质传递可以提高转染效率。该研究实验结果表明流速和Re都会影响该水孔平台的转染效率，随着Re的增加，转染效率有所提高，但存活率会降低。该研究将DNA折纸纳米结构成功递送至K562、MDA-MB-231等多种细胞中，在每分钟大于1.6×106个细胞的高通量下，对3～5 kDa的葡聚糖递送时，存活率近80%，转染效率可达90%。

图4 两种微流控水穿孔的装置：(a～c)水穿孔诱导细胞实现基因或分子递送的微流控水孔器(Hydroporator)设计与机理图；(d)每7 μs下高速显微镜记录的Hydroporator对细胞的挤压过程照片[54]；(e)液滴挤压平台的微流控装置与机理示意图以及对K562细胞转染3～5 kDa FITC-dextran的实验图片[57]

2021年Joo等人设计了一种液滴机械运作装置，由包裹着细胞和生物分子的液滴通过整体收缩来实现分子递送。这是一项具有创新性的研究(图4(e))，载有细胞和生物分子的液体通过流动聚焦结构生成细胞-生物分子液滴，当通过软光刻制备的PDMS收缩微通道时液滴被挤压，生物分子会通过对流和扩散介导的方式完成胞内递送[57]。因为递送的目标分子被装载在每个液滴中，微通道主要被运载油占据，所以需要的分子数量低，通道堵塞可以忽略不计。该研究以每分钟106个细胞的高通量，成功对K562、KG-1等多种细胞完成了大分子量葡聚糖、996 nt mRNA以及7.9 kbp质粒DNA的转染，转染效率高达95%。综上所述，基于细胞挤压的水穿孔技术具有高通量、高转染效率以及高细胞活性等优点，是一个具有巨大潜力的相对较新的研究领域。然而水穿孔技术目前仅局限于悬浮细胞类型，递送过程不均匀并且大多数微通道存在细胞堵塞，这些问题可能会限制其可用性[58]。

5 其他物理刺激辅助

细胞内物质递送的方法除了电穿孔、声穿孔、微注射和细胞挤压外，还有其他引发细胞外部刺激的物理方法用来完成物质递送，可大致分为内部刺激与外部刺激[59]。对于内部刺激，局部pH值、温度等微环境的差异是主要的刺激因素[60]。如固体肿瘤的pH值(pH≈6.5)低于血液或正常组织(pH=7.4)，因此低pH插入肽(pHLIP)等pH敏感分子可用于靶向酸性肿瘤组织[61]，这种pH差异还可以用于设计pH敏感囊泡，以增加肿瘤区域内的细胞内递送的效率。对于外部刺激，磁、光和热都可以作为刺激因素[62]，一定程度上影响细胞的物质递送。如Zhong等人利用激光在介质中的局部加热效应，形成两个串联的气泡，二者相互作用获得的二次Bjerknes力可产生速度达50 m/s的射流，其作用于细胞膜从而完成物质递送[63]。该方法的射流速度和流体剪切力可以精确控制，在细胞膜上形成的孔洞直径较大(几百纳米乃至微米量级)，但由于装置比较复杂，目前还只适用于单细胞操作。

6 总结与展望

微纳米技术的发展为外源性物质的胞内递送打开了新的视野，相较于传统生物方法，这些操作平台的成本低、生物相容性好，能够对各种细胞类型进行高效的高通量递送。本文总结了各种基于膜破坏的方式来进行物质递送的物理方法。这些技术有的可用于低至100 nm的高精度单细胞药物或分子递送，也有的用于在每分钟数百万个细胞的高通量下进行药物或分子递送，很多技术目前已经取得了实质性的进展。例如，可以进行单细胞操作并有较高转染效率的微注射和微针阵列的技术，转染效率高、成本低的细胞挤压和水穿孔技术，可以实现高通量下较高大分子转染效率的机械操作与电穿孔相结合的技术等。然而，目前的研究仍难以将超大生物分子、病原体等转染到各种类型的细胞中，并且现有的实验主要用于体外研究，直接完成体内递送的研究较少且有严格的局限性。所以能够实现高通量、低成本、较好的转染效率和细胞活性以及可直接应用于体内的递送技术或成为未来研究发展的方向。相信基于微纳米技术的体内外药物或分子递送以及进一步的实际临床应用将会迎来一个光明的未来。