灭蝇胺抗原抗体在豇豆、韭菜、芹菜快速检测中的应用研究

赵 颖 梁赤周 虞 淼 寿林飞

（1.杭州佰盛汇星生物科技有限公司， 杭州 311112； 2. 浙江省植保检疫与农药管理总站， 杭州 310009）

灭蝇胺是一种昆虫生长调节类低毒杀虫剂[1]，对双翅目昆虫（蝇类害虫） 有良好的杀虫活性。 灭蝇胺在瓜果蔬菜等农作物生产中被广泛使用， 导致蔬菜[2～3]和水果[4]中的灭蝇胺残留存在潜在膳食暴露风险， 其还被广泛应用于家畜养殖， 在鸡肉[5]、 牛奶[6]中存在一定的暴露水平。 因此， 人们对灭蝇胺膳食风险评估作了很多相关研究[3，7～8]。

2021 年6 月， 农业农村部等7 部委联合实施食用农产品 “治违禁 控药残 促提升” 三年行动， 治理的重点品种“三棵菜” 为豇豆、 韭菜、 芹菜， 鼓励食用农产品批发市场开办者对 “三棵菜”中腐霉利、 灭蝇胺等易超标的常规农药残留开展针对性速测。 2022 年， 浙江省农业农村厅征集的检测农产品及目标项目中包括了豇豆中的灭蝇胺。GB 2763－2021 《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[9]规定了灭蝇胺在豇豆、 芹菜、 韭菜上的最大残留限量 （MRL） 分别为0.5、 4、 3 mg/kg （参考葱）。 以上文件内容提到了 “三棵菜”中灭蝇胺残留易超标的问题， 也反映出对灭蝇胺快速检测产品的需求。 因此， 制备灭蝇胺抗原抗体并建立灭蝇胺金标试纸快检方法， 对“三棵菜” 中的灭蝇胺残留快速检测具有重要意义。

目前， 食品中灭蝇胺或其代谢产物三聚氰胺的检测分析方法主要有液相色谱法[10～12]、 液相色谱－质谱联用法[13～15]、 气相色谱－质谱联用法[16～18]、 表面增强拉曼光谱法[19～20]、 毛细管电泳非接触式电导检测法[21]、 金纳米探针法[22～24]、 时间分辨荧光试纸法[25]、 分子印迹聚合物膜法[26～27]。 另外， 三聚氰胺抗原抗体制备及其在动物源食品中灭蝇胺和三聚氰胺的检测分析应用已有报道[28～29]。 然而灭蝇胺抗原抗体制备及其免疫快检方法在“三棵菜” 上的应用鲜有报道， 因此， 本文开展灭蝇胺抗原抗体研究，从半抗原设计到完全抗原制备再到获得单克隆抗体， 后将抗原抗体应用于金标试纸制备， 从而建立一套“三棵菜” 中灭蝇胺的快检技术方法。

一、 材料与方法

（一） 材料与试剂豇豆、 韭菜、 芹菜样品，采集自浙江省各地区市场； Blab/c 小鼠 （雌性， 6周龄）， F1 代小鼠（雌性， 6 周龄）， 浙江省实验动物中心； 小鼠骨髓瘤细胞 （SP2/0）， 上海细胞库；NuncTM96 孔酶标可拆板/整板、 NuncTM6 孔/24 孔/96 孔细胞培养板、 NuncTM25 cm2/75 cm2细胞培养瓶、 15 mL/50 mL 离心管、 2 mL 细胞冻存管、 10 μL/200 μL/300 μL/1 000 μL 移液器吸头、 250 μL/500 μL 低吸附离心管， 美国Thermo 公司；SDS－PAGE 凝胶试剂盒， 南京金斯瑞公司； 2 mL进样瓶， 美国Waters 公司； 0.22 μm 针式滤膜（有机相）， 上海安谱实验科技股份有限公司。

钥孔血蓝蛋白（KLH）、 鸡卵清白蛋白（OVA）、兔抗鼠酶标二抗 （IgG－HRP）、 次黄嘌呤－胸腺嘧啶脱氧核苷添加剂（HT）、 黄嘌呤－氨基蝶呤－胸腺嘧啶脱氧核苷添加剂 （HAT）、 聚乙二醇（PEG1450）、 三水合氯金酸 （分析纯）、 柠檬酸三钠 （分析纯）， 美国Sigma 公司； 醋酸纤维膜CN140、 玻璃纤维膜8964， 美国Sartorius 公司；N－羟基琥珀酰亚胺 （NHS）、N，N－二环己基碳二亚胺（DCC）、N，N－二甲基甲酰胺（DMF）， 上海Aladdin 公司； 灭蝇胺标准品 （纯度99.24%）、 三聚氰胺标准品（纯度99%）、 敌菌灵标准品 （纯度99.3%）、 均三嗪标准品 （纯度99%）， 德国Dr.Ehrenstorfer 公司； 乙腈（色谱纯）， 德国Merck 公司； 盐酸、 氢氧化钠、 磷酸氢二钠、 磷酸二氢钠、碳酸钾、 乙酸铵、 二氯甲烷 （均为分析纯）， 国药集团上海有限公司； 单组分3，3'，5，5'－四甲基联苯胺 （TMB）、 弗式佐剂、 羊抗鼠IgG， 苏州博奥龙科技有限公司； 低内毒素胎牛血清， 浙江四季青公司； 高糖培养基DMEM， 杭州吉诺公司； 氨基净化柱（500 mg/6 mL）， 美国Waters 公司。

（二） 仪器与设备超纯水系统Milli－Q， 美国Millipore 公司； 旋涡混合器SCI LoGex MX－S，美国Scilogex 公司； 磁力搅拌器85－1， 上海志威公司； 多功能酶标仪SpectraMax@ i3， 美国Molecular Devices 公司； 微量分光光度计Nano－100， 杭州奥盛仪器公司； 超声波清洗器， 苏州昆山超声公司； 二氧化碳培养箱MCO－18AIC， 日本松下公司； 倒置显微镜DMI1， 德国Leica 公司；低温高速离心机Fresco21、 单通道移液器、 多通道可调移液器， 美国Thermo 公司； 洗板机HW2096，深圳华科瑞公司； 超净工作台SW－CJ－1FD， 苏州苏净安泰公司； 低速离心机DL－5－B， 上海安亭公司； 蛋白电泳仪， 美国Bio－Rad 公司。

（三） 实验方法

1.半抗原设计与合成。 本研究的关键技术是获得高亲和力和高灵敏度的灭蝇胺抗体， 重点在于半抗原的设计与合成。 灭蝇胺半抗原与目标待测物相似度高（见图1）， 对灭蝇胺的特征结构保留完整，为灭蝇胺抗体制备奠定了基础。

称取2 g 2－氨基三聚氰胺溶于KOH 碱性无水DMF 溶液中， 进行N－烃化反应， 加入1.5 倍摩尔当量的溴代己酸甲酯， 搅拌条件下升温至80℃，反应得到三聚氰胺氨基己酸甲酯（由于反应是在无水条件下进行， 不涉及pH 控制， 因此不会对侧链甲酯发生水解）。 加入2 倍摩尔当量的NaOH 水溶液， pH 约14， 在碱性条件下， 三聚氰胺氨基己酸甲酯水解成三聚氰胺氨基己酸， 冷却至10℃， 抽滤得到的固体样品用1，4－二氧六环重结晶， 干燥后得到灭蝇胺半抗原（见图2）。

图2 灭蝇胺半抗原合成路线

2.完全抗原制备。 由于灭蝇胺分子本身不具备免疫原性， 需要将分子连接于蛋白载体， 从而获得免疫原性。 经改造后的灭蝇胺半抗原分子引入了氨基己酸， 可与蛋白分子上的氨基缩合形成稳定的酰胺键， 一个蛋白分子能连接20～300 个半抗原分子。

采用碳二亚胺法制备灭蝇胺免疫抗原， 称0.005 mmoL 灭蝇胺半抗原溶于0.2 mL DMF 中，加入0.01 mmoL EDC 和0.01 mmoL NHS， 室温搅拌反应4 h， 得到灭蝇胺半抗原活化液。 用0.01 moL/L 碳酸缓冲液 （pH 9.0） 配置5 mg/mL 的KLH 溶液， 室温搅拌条件下逐滴加入上述半抗原活化液， 再改为缓慢磁力搅拌反应3 h。 将反应溶液进行透析处理， 得到免疫抗原灭蝇胺－KLH。

采用混合酸酐法制备灭蝇胺竞争抗原， 称0.01 mmoL 灭蝇胺半抗原溶于0.2 mL DMF 中， 搅拌下加入0.02 mmoL 三正丁胺和0.02 mmoL 氯甲酸异丁酯， 室温搅拌反应1 h， 得到灭蝇胺半抗原活化液。 用0.01 moL/L 碳酸缓冲液 （pH 9.0） 配置10 mg/mL 的OVA 溶液， 室温搅拌条件下逐滴加入上述半抗原活化液， 继续搅拌反应3 h， 将反应溶液进行透析处理， 得到竞争抗原灭蝇胺－OVA。

3. 免疫与血清监测。 采用皮下多点免疫方式，将灭蝇胺－KLH 免疫于Blab/c 小鼠， 初次免疫剂量200 μg/ 只， 2 次至末次免疫剂量100 μg/ 只，免疫间隔时间14 d。 初次免疫将灭蝇胺－KLH 与完全弗氏佐剂1∶1 乳化混合， 2 次至末次免疫前1次免疫将灭蝇胺－KLH 与不完全弗氏佐剂1∶1 乳化混合， 末次免疫不加佐剂。

3 次和4 次免疫后1 周， 采用同源间接竞争ELISA 法测定小鼠血清效价以及对灭蝇胺的抑制率， 以吸光度值OD450nm≥1 为效价标准， 若效价达到10 000 以上， 且对1 mg/L 浓度的灭蝇胺抑制率＞50%， 可对小鼠进行末次免疫。

4.单克隆细胞筛选与抗体制备。 小鼠末次免疫3 d 后， 取小鼠脾脏细胞与SP2/0 细胞杂交融合，细胞培养加入HAT 与HT 筛选试剂， 筛选单克隆杂交瘤细胞。 采用同源间接竞争ELISA 法， 包被10 μg/mL 灭蝇胺－OVA， 以灭蝇胺标准溶液100 ng/mL 作为竞争药物， 筛选出细胞上清液阳性OD450nm≥0.5 且抑制率≥50%的细胞株， 连续亚克隆2 次， 筛选单克隆细胞孔并进行阳性和抑制率测试， 获得稳定的灭蝇胺单克隆杂交瘤细胞株。

将灭蝇胺单克隆杂交瘤细胞株 （细胞密度约2×105个/mL） 以500 μL/ 只的剂量接种于F1 代小鼠腹腔， 1 周后小鼠腹腔开始膨胀， 收集小鼠腹水， 并采用辛酸－硫酸铵沉淀法纯化腹水， 得到灭蝇胺单克隆抗体。 进行SDS－PAGE 凝胶电泳分析， 鉴定抗体轻重链与纯化效果。 通过ELISA 法检测抗体对灭蝇胺、 三聚氰胺、 敌菌灵和均三嗪的抑制率（%）， 按公式（1） 计算。

5.金标试纸制备。 采用胶体金免疫层析方法制备灭蝇胺金标试纸。 将竞争抗原灭蝇胺－OVA 和羊抗鼠IgG 划膜于醋酸纤维膜 （NC 膜） 分别用于检测线（T 线） 和质控线（C 线）， 优化划膜浓度。胶体金标记灭蝇胺抗体用于检测探针， 优化标记pH 和抗体稳定量。 优化准则[30]： 检测空白样品时T 线显色最深， 检测灭蝇胺0.1 mg/L 标准溶液样品时T 线不显色。

金标试纸的组装见图3。 如图3 所示， T 线（5）和C 线（6）分别包被于NC 膜（2）上， 并根据先后顺序， 将NC 膜、 吸水垫（7）、 金标杯（4）、 样品垫（3）依次粘于衬板（1）上。 将组装好的试纸切成3 mm 宽的试纸条， 于干燥柜中保存并控制湿度30%以内。

图3 金标试纸的构成示意

6.金标试纸性能评价方法。 配置灭蝇胺标准母液100 mg/L （ 甲醇） ， 稀释成0.006、 0.012、0.025、 0.05、 0.1、 0.2 mg/L 标准工作液 （含20%甲醇的0.01 mol/L PBS）。 取标准工作溶液100 μL滴加于金标试纸样品孔， 反应10 min 时判断T 线显色情况。 T 线显色等于、 深于或略浅于C 线表示样品中灭蝇胺的浓度低于检出限 （阴性）； T 线不显色表示样本中灭蝇胺的浓度等于或高于检出限（阳性）， 从而确定检出限浓度。

7. “三棵菜” 中灭蝇胺金标试纸快检方法。 实际样品检测选取豇豆、 芹菜、 韭菜， 分别设置空白样本和灭蝇胺阳性添加样本， 灭蝇胺标准溶液添加浓度为0.1、 0.5、 2.5 mg/kg。 准确称取1.0 g 匀浆样品至15 mL 离心管， 加入10 mL 提取试剂 （含20%甲醇的0.01 mol/L 磷酸缓冲液）， 涡旋振荡30 s， 于离心机中以4 000 r/min 离心3 min， 取上清液100 μL 用于金标试纸快速检测， 检测流程见图4。 此提取方法通过样品稀释去除基质干扰， 样品稀释倍数为10 倍条件下， 用于试纸检测时无基质干扰现象。

图4 “三棵菜” 中灭蝇胺快速检测流程

8.仪器参比方法。 样品制备、 提取与净化： 准确称取20 g 匀浆样品于250 mL 烧杯中， 加入40 mL 乙腈， 用高速匀浆机匀浆提取1 min， 匀浆液过滤到装有5 g 氯化钠的100 mL 具塞量筒中， 剧烈振荡1 min， 室温下静置30 min。 吸取10 mL 乙腈相至50 mL 烧杯中， 于80℃水浴加热并氮吹，待乙腈蒸发至干， 加入2.0 mL 甲醇－二氯甲烷（1∶9， 体积比） 溶解， 盖上铝箔， 待净化。 将氨基净化柱用4.0 mL 甲醇－二氯甲烷 （1∶9， 体积比）预洗柱， 当溶剂液面到达柱吸附层表面时， 立即加入上述待净化溶液， 收集洗脱液， 用4.0 mL 甲醇－二氯甲烷（1∶9， 体积比） 洗烧杯后过柱， 合并洗脱液。 将洗脱液氮吹至近干， 用甲醇准确定容至2.0 mL， 超声溶解后加入约2.0 mL 超纯水， 并用超纯水准确定容至5.0 mL。 在混合器上混匀后，经0.22 μm 滤膜过滤后供液相色谱串联质谱测定。

液相色谱串联质谱测定条件： Waters C18色谱柱 （2.6 μm， 2.1 mm×100 mm）； 流动相A 为5 mmol/L 乙酸铵水溶液， B 为甲醇； 流速0.3 mL/min。 流动相梯度洗脱条件： 0～2 min， 80%A～20%A； 2～4 min， 20%A～5%A； 4～6 min，5%A； 6～6.1 min， 5%A～80%A； 6.1～8 min，80%A。 柱温40℃； 进样量1 μL。 电喷雾离子源（ESI）， ESI 正离子电压5 000V； 离子源温度500℃； 辅助加热气379 kPa； 气帘气压力241 kPa；定量离子对（m/z）167.0/125.0， 定性离子对（m/z）167.0/125.0、 167.0/108.0， 去簇电压46 V， 碰撞电压25、 29 V， 碰撞室出口电压6、 6 V。

（四） 数据计算采用Spectrophotometer V2.1、Masshunter， 以及Microsoft Excel 2019、 Origin 2021 软件对检测结果进行统计和数据分析。

二、 结果与分析

（一） 灭蝇胺半抗原鉴定质谱鉴定采用ESI正离子模式{HRMS （ESI－TOF）m/z： [M+H]+}，质荷比扫描得到相对分子质量为256.15 的化合物，推算得到分子式为C9H18N7O2， 通过归一法计算得到纯度为97.0%， 详见图5。 核磁氢谱鉴定采用400 M 核磁共振仪［1H NMR（400 MHz， CD3OD）］， 化学位移值显示结构中含己酸侧链上的10 个氢， 分别表述为δ1.39～1.43 （m，2H）， 1.55～1.59 （m，2H），1.61～1.67 （m，2H）， 2.32 （t，J＝7.2 Hz，2H）， 2.75～2.86 （m，2H）， 详见图6。 上述结果表明灭蝇胺半抗原连接了己酸侧链， 与设计合成的结构一致。

图5 灭蝇胺半抗原的质谱图

图6 灭蝇胺半抗原的核磁氢谱图

（二） 灭蝇胺完全抗原评价灭蝇胺－KLH、灭蝇胺－OVA、 载体蛋白KLH 和OVA、 半抗原分别通过紫外光谱扫描鉴定。 紫外吸收光谱显示， 半抗原、 完全抗原与载体蛋白之间存在明显的吸收峰偏移（见图7）， 证明完全抗原偶联成功。

图7 紫外光谱图

（三） 抗体纯化与鉴定灭蝇胺腹水抗体进行辛酸－硫酸铵沉淀法纯化后， 通过SDS－PAGE 凝胶电泳鉴定分析， 出现显著的轻链 （25 kD） 和重链 （50 kD） 条带， 且无其他杂条带 （见图8）， 由此判断抗体纯化效果良好。 纯化得到的抗体经微量分光光度计测定浓度为5.3 mg/mL。

图8 SDS-PAGE 凝胶电泳图

（四） 灭蝇胺抗体性能检测通过细胞融合筛选出1 株稳定分泌灭蝇胺抗体的单克隆杂交瘤细胞株， 使用同源间接竞争ELISA 法测定抗体亲和力以及与灭蝇胺类似结构化合物三聚氰胺、 敌菌灵、均三嗪的交叉反应情况， 结果见图9。 如图9 所示， 抗体对灭蝇胺和三聚氰胺显示为双特异性， 对敌菌灵和均三嗪无显著特异性。 灭蝇胺抑制曲线的线性方程为y＝15.612 ln（x）+24.104，R2＝0.996，IC50＝5.3 μg/L； 三聚氰胺抑制曲线的线性方程为y＝14.542 l n（x）+24.367，R2＝0.991， IC50＝5.8 μg/L。

图9 灭蝇胺抗体亲和力和交叉反应曲线

（五） 金标试纸制备关键性参数制备灭蝇胺金标免疫识别探针， 优化得到最适标记pH 和最适抗体稳定量， 得到的金标抗体具有最优探针显色效果并可有效识别灭蝇胺， 同时， 优化得到最适T线和C 线组合， 优化结果见表1。

表1 灭蝇胺金标试纸关键参数优化值

（六） 金标试纸性能评价结果灭蝇胺标准工作液的金标试纸检测结果见图10。 如图10 所示，随着灭蝇胺浓度的提高， T 线显色逐渐减弱， 当灭蝇胺浓度为0.05 mg/L 时T 线完全消失。 显色结果表明T/C 与灭蝇胺浓度之间具有良好的相关性， 灭蝇胺的检出限为0.05 mg/L， 可通过显色直接判读灭蝇胺的检出情况。

图10 灭蝇胺标准溶液 （浓度单位： mg/L） 的金标试纸显色结果

（七） 方法准确度为评价金标试纸快检方法的准确度， 本研究对豇豆、 芹菜、 韭菜样品进行了加标实验 （加标浓度分别为0.1、 0.5、 2.5 mg/kg），分别对加标样品进行金标试纸方法检测和仪器参比方法检测， 设置3 个平行， 5 次重复 （n＝5）， 实验结果见表2。 如表2 所示， 灭蝇胺添加浓度小于0.5 mg/kg的样本， 仪器参比方法实测浓度符合添加浓度水平， 其试纸检测结果均显示阴性； 灭蝇胺添加浓度大于或等于0.5 mg/kg 的样本， 仪器参比方法实测浓度符合添加浓度水平， 其试纸检测结果均显示阳性。 结果表明， 金标试纸方法与仪器参比方法结果一致， 具有良好的准确度， 样品中的检出限为0.5 mg/kg， 可用于灭蝇胺的定性和半定量分析。

表2 金标试纸对豇豆、 芹菜、 韭菜加标样品的检测结果与仪器实测结果比对 （n＝5）

（八） 实际样品测定从浙江省各地区市场随机抽检豇豆、 芹菜、 韭菜样品各5 份， 用仪器参比方法定量检测样品中灭蝇胺残留量， 并用本研究建立的金标试纸快检方法检测得出半定量结果（见表3）。 快检方法结果与定量检测方法结果比对， 符合率为93.3%， 其中豇豆－4 样品存在灭蝇胺超标，其他样品均未超标， 表明快检方法在实际样品分析中准确性较高。

表3 豇豆、 芹菜、 韭菜实际样品定量检测和快速检测比对结果

三、 结论

本研究成功合成了灭蝇胺半抗原， 制备了灭蝇胺完全抗原， 获得了灭蝇胺单克隆抗体， 并以此建立了灭蝇胺金标试纸快速检测方法。 抗体对灭蝇胺、 三聚氰胺显示为双特异性， IC50分别为5.3、5.8 μg/L， 对其他结构类似化合物无交叉反应。 灭蝇胺标准溶液的试纸检测结果显示， 显色结果与标准溶液浓度之间呈负相关， 即浓度越高， T 线显色越浅。 豇豆、 芹菜、 韭菜的加标实验结果表明方法具有良好的准确度， 样品中的检出限为0.5 mg/kg。快检方法应用于实际样品检测， 与仪器参比方法结果符合率达93.3%。 综上得出， 本研究建立的灭蝇胺快检方法可实现 “三棵菜” 中灭蝇胺残留的快速、 准确、 定性、 半定量分析。 此外， 样品的前处理过程简易、 快速、 环保， 有较强的现场检测实用性， 可为“三棵菜” 中灭蝇胺快速检测提供技术保障， 并为我国建立灭蝇胺金标试纸快速检测标准提供重要参考数据。