酶化石复合菌粉抑制大鼠肾结石形成及对肾功能的保护作用

李本根,朱 焓,付梓峰,李 成

(遵义医科大学附属医院 泌尿外科,贵州 遵义 563099)

肾结石是工业化社会中最常见的泌尿系统疾病之一,超过80%的肾结石为草酸钙结石[1]。目前肾结石主要治疗方法分为手术治疗和非手术治疗,以手术取石为主[2]。虽然设备的改进及医生操作水平的提高使得结石清除达到满意的疗效,但肾结石的10年复发率仍高达50%[3],给患者带来了沉重的经济及心理负担。因此,降低结石复发率显得至关重要。目前研究认为高草酸尿、高钙尿症和活性氧诱导的氧化应激在草酸钙结石的形成中至关重要[4-7],因此降低尿液中草酸和Ca2+浓度可以预防结石复发。临床将枸橼酸氢钾钠颗粒作为含钙结石预防用药,其治疗机理为碱化尿液及提高尿枸橼酸含量,临床用药较为单一。因此,通过益生菌干预调控肠道吸收草酸治疗高草酸尿症预防草酸钙肾结石成为研究热点[8]。由武汉康复得生物科技股份有限公司生产的酶化石复合菌粉通过食用菌发酵获得的草酸降解酶调控肠道对草酸吸收,从而降低尿液中草酸含量,受到泌尿外科学者关注[9-10]。但是否可以抑制肾结石形成及对肾功能是否具有保护作用临床争议较大,因此探讨酶化石复合菌粉治疗效果具有重要意义。本研究通过酶化石复合菌粉治疗草酸钙结石大鼠,观察结石及肾功能相关指标的变化,从而探索其治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠24只,SPF级,雄性10周龄,体重250～300 g,购买自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0010。饲养条件:温度20～26 ℃,湿度为30%～70%。本研究严格遵守国际通行的动物福利与伦理准则,动物实验通过遵义医科大学附属医院实验动物福利与伦理委员会审批(NO:ZMC21-2207-015)。

1.2 实验试剂与仪器 酶化石复合菌粉(武汉康复得生物科技股份有限公司);枸橼酸氢钾钠颗粒(武汉维奥制药有限公司);苏木素返蓝液、伊红染色液(Servicebio);草酸检测试剂盒(sigma);钙检测试剂盒、尿素检测试剂盒、肌酐检测试剂盒(山东博科);大鼠用丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒、过氧化氢酶(catalase, CAT)试剂盒;组织脱水机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司);兔抗NF-κB p65抗体(AF5006,Affinity);兔抗STAT3抗体(AF6294,Affinity);兔抗TNF-α抗体(AF7014,Affinity);兔抗IL-1β抗体(AF5103,Affinity);石蜡包埋机(Leica);切片机(Leica);摊片机(Leica);显微镜(OLYMPUS);全自动酶标仪(北京六一);全自动生化分析仪(山东博科)。

1.3 草酸钙结石大鼠模型建立 动物适应性饲养7 d后,通过连续28 d饮用1%乙二醇水构建草酸钙结石大鼠模型[11]。对照组给予普通饮用水,模型组、酶化石粉组、枸橼酸氢钾钠组饮用1%乙二醇水,同时酶化石菌粉组按0.4 g/kg(以成人体重70 kg按体表面积法进行人-鼠间给药量进行换算)剂量灌胃酶化石菌粉,枸橼酸氢钾钠组按0.9 g/kg(以成人体重70 kg按体表面积法进行人-鼠间给药量进行换算)灌胃枸橼酸氢钾钠。药物配制的方法为:称取酶化石菌粉 9.8 g,溶于245 mL纯水,浓度为0.04 g/mL;称取枸橼酸氢钾钠22.5 g,溶于250 mL纯水,浓度为0.09 g/mL。

1.4 生化检测 第0天及第28天收集尿液,尾静脉采集血液。造模结束后0、28 d,取大鼠血液、尿液行生化检测,血液用于测定血清尿素氮、肌酐和 Ca2+浓度;尿液用于测定尿草酸盐和尿 Ca2+浓度。取血清和尿液样本,5 000 g离心10 min,上机检测。开机前检查供水、检查电源和检查废液连接;打开仪器总电源,打开仪器制冷电源和打开仪器主控电源;打开操作软件确认仪器状态,准备试剂探测试剂余量进行定标质控测试,录入检测项目尿素氮、肌酐和 Ca2+开始测试,测试完将数据导出,仪器维护保养后关闭仪器电源 。采用生化试剂盒检测草酸的水平。取大鼠尿液样本5 000 g离心10 min,按照试剂盒说明书进行草酸检测,用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度(OD)值。

1.5 大鼠肾组织氧化应激水平检测 采用ELISA检测MDA、SOD、GSH-PX、CAT的水平。取28 d后各组大鼠血清,5 000 g离心10 min,按照说明书进行操作,具体操作步骤如下:ELISA试剂盒室温下复温,配制标准液,设置空白孔、标准孔和样本孔,空白孔中不加样本及酶标试剂,向其余各孔中加入50 μL样本或标准品,加入酶标试剂100 μL,37 ℃孵育1 h。洗板5次后,加入显色剂,37 ℃孵育15 min,加入终止液终止反应,在450 nm波长下检测各孔吸光度值,根据相应公式计算浓度。

1.6 HE染色及偏光显微镜观察大鼠肾脏组织草酸钙晶体形成 实验结束后断颈处死各组大鼠,取左肾肾组织石蜡切片(4～6 μm)经烤片、脱蜡、水化后,用苏木素染液染色3～5 min,流水冲洗后,用1%盐酸酒精分化,反蓝液反蓝,伊红染色3～5 min后,切片脱水,封片。在偏光显微镜下观察肾组织草酸钙晶体沉积情况。观察5个视野中大鼠肾组织肾小管草酸钙晶体形成情况并拍照,统计每个视野草酸钙晶体数量,取平均值,共重复10次。

1.7 免疫组化检测NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在肾组织中的表达 采用免疫组化检测NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在肾组织中的表达情况。大鼠右肾组织切片,烤片、脱蜡、水化后,用柠檬酸缓冲液进行抗原修复。经5% BSA抗原封闭后,用兔抗NF-κB p65抗体(1∶100)、兔抗STAT3抗体(1∶100)、兔抗TNF-α抗体(1∶100)、兔抗IL-1β抗体(1∶100)进行一抗孵育,4 ℃过夜后,进行辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶100)孵育,经DAB显色,苏木精复染反蓝,脱水透明后,封片,在显微镜(BX43,Olympus)下进行观察。

2 结果

2.1 各组大鼠尿液、血液生化基线指标 大鼠模型建立成功前,对各组大鼠尿液中的Ca2+、草酸,及血清中的尿素、肌酐、Ca2+等指标进行检测,其差异均无统计学意义(P<0.05),提示具有可比性(表1)。

表1 大鼠尿液、血液生化基线指标(n=6)

2.2 酶化石复合菌粉对大鼠肾脏中草酸钙结晶沉积的影响 如图1所示,对照组大鼠肾小球结构正常,部分肾小管管腔扩张,无草酸钙结晶,无炎性细胞浸润。模型组中,结构紊乱,肾小管管腔内充满草酸钙结晶,间质可见炎性细胞浸润。与模型组对比,酶化石复合菌粉治疗组、枸橼酸氢钾钠组的肾小管结构紊乱减轻,肾小管管腔内充满草酸钙结晶减少,炎性浸润大量减少。

A:对照组;B:模型组;C:酶化石复合菌粉组;D:枸杞酸氢钾钠组,箭头表示结晶位置;标尺为100 μm。

2.3 酶化石复合菌粉对大鼠尿液草酸及Ca2+浓度,及血清中的尿素、肌酐、Ca2+的影响 如表2所示,28 d尿液中的Ca2+、草酸与对照组相比,模型组显著升高(P<0.05)。与模型组比较,酶化石复合菌粉治疗组、枸橼酸氢钾钠组的Ca2+、草酸含量均下降(P<0.05)。28 d血清中,与对照组相比,尿素、肌酐在模型组中升高(P<0.05)。与模型组相比,尿素、肌酐在酶化石复合菌粉治疗组、枸橼酸氢钾钠组的含量下降(P<0.05),而血清Ca2+在各组之间的含量差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 干预28d时大鼠尿液、血液生化指标(n=6)

2.4 酶化石复合菌粉对大鼠血清氧化应激指标的影响 如图2所示,与对照组比较,模型组CAT、GSH-PX和SOD指标水平下降,而MDA指标水平升高(P< 0.05)。与模型比较,酶化石复合菌粉治疗组和枸橼酸氢钾钠组中CAT、GSH-PX和SOD指标水平升高,而MDA指标下降(P<0.05)。

*:与对照组比较,P <0.05;#:与模型组比较,P < 0.05。

2.5 酶化石复合菌粉对大鼠肾脏NF-κB p65、STAT3、TNF-α及IL-1β表达的影响 如图3及图4所示,通过免疫组化方法对大鼠肾脏染色,明确大鼠肾脏NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β的表达。结果显示,与正常组比较,模型组NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在肾脏组织中的表达上升(P<0.05);与模型比较,酶化石复合菌粉治疗组和枸橼酸氢钾钠组中NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β表达降低(P<0.05)。

比例尺 400∶1。

*:与对照组比较,P <0.05;#:与模型组比较,P<0.05。

3 讨论

目前研究认为高草酸尿、高钙尿是引起肾结石发生的重要原因[3-4]。血清肌酐及尿素水平在肾小球损伤或功能减退时升高,研究发现肾结石也可引发血清中的肌酐和尿素含量升高[12-13]。在我们构建的草酸钙结石大鼠模型中,HE结果显示模型组大鼠肾组织结构紊乱,部分肾小管管腔内充满草酸钙结晶。在本研究中,我们同样发现,模型组的大鼠(28 d)钙离子(Ca2+)、草酸在尿液的含量增加,肌酐、尿素在血清中的含量增加。当我们用酶化石复合菌粉治或枸橼酸氢钾钠治疗后,肌酐、草酸在尿液的含量下降,肌酐、尿素在血清中的含量下降。枸橼酸氢钾钠颗粒作为治疗肾结石有效药物之一,其治疗机理为碱化尿液及提高尿枸橼酸含量抑制肾结石形成.而酶化石复合菌粉治疗机理则是通过食用菌发酵获得的草酸降解酶调控肠道对草酸吸收,降低尿液中草酸含量抑制肾结石形成。我们的结果发现酶化石复合菌粉治疗组和枸橼酸氢钾钠治疗组都可以降低尿液中Ca2+、草酸及血清中尿素、肌酐,但两者之间无显著性差异,说明酶化石复合菌粉可以起到类似枸橼酸氢钾钠颗粒减轻肾结石的作用。

近年来,有研究[14]表明氧化应激损伤参与肾结石的发生。结石患者血清中抗氧化酶水平与正常组相比有所下降。CAT作为一种过氧化氢酶,可以分解H2O2并可能调节细胞中活性氧,具有抗氧化应激的作用,保护器官免受活性氧的伤害[11]。活性氧的产生是氧化应激诱导的关键步骤,导致丙二醛(MDA)、NO和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平升高,SOD、CAT和GSH-px水平降低[15]。GSH-Px可以保护细胞免受过氧化物引起的氧化损伤[16]。CAT、GSH-Px在结石的肾脏组织中含量低,致使器官丧失了及时清除过氧化产物(如活性氧、MDA)的能力,导致组织损伤[17-18]。在模型组中CAT、GSH-Px、SOD的含量下降,而MDA含量上升,说明模型组大鼠遭受了过氧化损伤。当酶化石复合菌粉治或枸橼酸氢钾钠治疗后,CAT、GSH-Px、SOD含量上升,MDA含量下降,说明药物减轻了机体的氧化应激损伤。

氧化应激诱导的氧化产物水平的升高会通过NF-κB和JAK-STAT通路导致一系列炎症因子的释放[14]。NF-κB家族由五种蛋白质组成,通过形成同源或异源二聚体发挥作用[19]。NF-κB抑制因子α(IκBα)与p65的核定位信号(NLS)的结合,使p50/p65在细胞质中保持非活性;当存在TNF-α时,会激活IκB激酶(IKK),激活的IKKβ磷酸化IκBα,促使IκBβ泛素化并被蛋白酶体降解,随后p50/p65易位进入细胞核,激活下游基因的表达[20]。NF-κB p65、STAT3在肾结石发生中有重要作用,会促进肾脏器官的损伤,并造成炎症[21-24]。我们同样发现,NF-κB p65、STAT3及炎症因子(TNF-α、IL-1β)在模型组肾脏组织中的表达量增加;用酶化石复合菌粉治或枸橼酸氢钾钠治疗后,NF-κB p65、STAT3及炎症因子(TNF-α、IL-1β)表达量下降。说明酶化石复合菌粉可以减轻肾脏炎症反应。

综上所述,酶化石复合菌粉能够降低尿草酸、Ca2+含量,增强抗氧化应激,具有抑制肾结石形成及对肾功能的保护作用。该结果可为后续的机制研究提供基础数据或依据。不足之处是本研究仅初步明确了酶化石复合菌粉可以抑制大鼠肾结石形成及对肾功能具有保护作用,有待进一步证实并揭示酶化石复合菌粉对草酸钙结石形成的抑制及保护肾功能作用机制,有望为临床草酸钙结石的防治提供一种新的药物。