羌活胜湿汤物质基准多指标成分含量测定及量值传递分析*

王敏，薛志峰，孙新茹，李丹丹，王志娟，惠玉玉，刘志东

（1.天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程中心，天津 301617；2.天津中医药大学，组分中药国家重点实验室，天津 301617；3.哈尔滨珍宝制药有限公司，哈尔滨 150040）

羌活胜湿汤（QSD）出自金代医家李东垣所著《内外伤辨惑论》[1]，由羌活、独活、藁本、防风、川芎、炙甘草、蔓荆子7 味中药组成，具有祛风胜湿止痛之功，主治风湿在表之痹证，是临床祛风湿止痛的中药复方。现代临床研究表明本方主要用于关节炎、颈椎病、偏头痛、肩背疼痛等疾病的治疗[2]。经典名方是近年来的研究热点，其复方制剂是中药产品发展的重要途径[3]，而经典名方物质基准更是其复方制剂研发和开展的核心内容，QSD 被收录在国家中医药管理局发布的第1 批古代经典名方目录中。目前，关于QSD 的文献报道多集中于药理作用及临床应用领域，物质基准方面鲜有研究。本研究根据国家药品监督管理局发布的《古代经典名方关键信息考证原则》等相关指导原则，通过制备15 批经典名方QSD 物质基准冻干粉，采用高效液相（HPLC）法建立QSD 多指标成分含量测定方法，测定其指标成分含量，进行饮片到物质基准之间的量值传递分析，为经典名方QSD 后续的研究及相关制剂研发的质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 1260 型高效液相色谱仪，DAD 检测器，美国Agilent 公司；AX205 型十万分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；FA124 型万分之一天平，天津亿诺科学仪器有限公司；Milli-Q 超纯水系统，美国Millipore 公司；DZL 煎药壶，潮州市潮安区康尔顺贸易有限公司；TDGC2-3KVA 型接触式调压器，飘风电器有限公司；N-10000 旋转蒸发仪，日本EYELA 公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴槽，天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-400B 超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；FW100 型万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；B-290 型喷雾干燥仪，瑞士Buchi 公司；DZF-6090 型真空干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；FDU-2100 型冷冻干燥机，日本EYELA 公司。

1.2 试药 羌活醇（111820-201504，含量以99.9%计）、二氢欧山芹醇当归酸酯（111583-201605，含量以98.6%计）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（111523-201610，含量以96.1%计）、蔓荆子黄素（111554-201705，含量以98.3%计）、异欧前胡素对照品（110827-201611，含量以99.4%计）、甘草酸铵对照品（110731-201619，含量以93.0%计）均购自中国食品药品鉴定研究所；甲醇（色谱级，赛默飞世尔科技有限公司），乙腈（色谱级，赛默飞世尔科技有限公司），磷酸（色谱级，批号130271，赛默飞世尔科技有限公司），实验室自制超纯水；QSD 物质基准15 批次，批号及所用饮片产地信息见表1，由黑龙江珍宝岛药业股份有限公司提供，经过天津中医药大学祁东利副研究员鉴定羌活NOTOPTERYGⅡRHIZOMA ET RADIX、独活ANGELICAE PUBESCENTIS RADIX、藁本LIGUSTICI RHIZOMA ET RADIX、防风SAPOSHNIKOVIAE RADIX、炙甘草GLYCYRRHIZAE RADIX ET RHIZOMA PRAEPARATA CUM MELLE、川芎CHUANXIONG RHIZOMA、蔓荆子VITICIS FRUCTUS 均符合《中华人民共和国药典》2020年版要求。

表1 15 批QSD 物质基准组合信息表

2 方法与结果

2.1 指标成分含量测定 色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱。流动相为乙腈-0.05%磷酸水。洗脱梯度：0～15 min，12%～15%乙腈；15～37 min，15%～19%乙腈；37～52 min，19%～24%乙腈；52～64 min，24%～27%乙腈；64～75 min，27%～37%乙腈；75～92 min，37%～50%乙腈；92～109 min，50%～58%乙腈；109～113 min，58%～90%乙腈；113～125 min，90%乙腈。柱温30 ℃。体积流量0.8 mL/min。进样量10 μL。检测波长：254（检测5-O-甲基维斯阿米醇苷和蔓荆子黄素）、310（检测羌活醇和异欧前胡素）、237（检测甘草酸铵）、330（检测二氢欧山芹醇当归酸酯）nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取5-O-甲基维斯阿米醇苷、蔓荆子黄素、羌活醇、异欧前胡素、甘草酸铵、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，加入甲醇制成1 mL 含18.08 μg 5-O-甲基维斯阿米醇苷、4.47 μg 蔓荆子黄素、44.7 μg 羌活醇、8.016 μg 异欧前胡素、504 μg 甘草酸铵、4.29 μg 二氢欧山芹醇当归酸酯的混合对照品溶液。

2.3 QSD 物质基准冻干粉的制备 采用随机数字表法，分别对方中各饮片进行随机组合，见表1。《内外伤辨惑论》原文记载的QSD 处方及制法为“羌活、独活各一钱，藁本、防风、甘草（炙）、川芎各五分，蔓荆子三分。上咀，都作一服，水二盏，煎至一盏，去渣，大温服，空心食前”。经前期考证，确定处方剂量为羌活、独活各3.0 g，川芎、藁本、炙甘草、防风各1.5 g，蔓荆子0.9 g。取各饮片置于砂锅中，加入去离子水400 mL，浸泡30 min 后煎煮至药液体积剩余约200 mL，使用两层纱布趁热过滤，置于室温冷却后，将标准汤剂旋转蒸发至流浸膏，预冻后冷冻干燥，即得15 批QSD 物质基准冻干粉，同法制备各阴性冻干粉。

2.4 供试品溶液的制备 取“2.3”项下制备的QSD冻干粉0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密移取60%甲醇（v/v）10 mL，称取质量，320 W、40 kHz 超声处理45 min，放冷至室温，补足失去质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5 含量测定方法学考察

2.5.1 专属性考察 分别精密吸取按“2.2”项及“2.4”项下制备得到的各对照品溶液、供试品溶液及各阴性样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别进样分析，记录色谱图，见图1。结果显示，阴性对照图中显示对5-O-甲基维斯阿米醇苷、蔓荆子黄素、羌活醇、异欧前胡素、甘草酸铵、二氢欧山芹醇当归酸酯的测定无干扰。

图1 QSD 专属性考察HPLC 图

2.5.2 线性关系考察 精密吸取按“2.2”项下制备的混合对照品溶液适量，用甲醇稀释成不同质量浓度的系列对照品溶液。按“2.1”项下的色谱条件进样分析，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，绘制标准曲线，如表2所示。结果表明，各指标成分线性关系良好。

表2 QSD 物质基准中指标性成分含量测定方法学考察

2.5.3 精密度实验 精密吸取一定浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下的含量测定色谱条件进样洗脱，连续进样6 次，记录各指标成分峰面积，计算得到的峰面积RSD值均小于3.00%，结果表明该方法仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性实验 取同一批物质基准供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24、36、48 h 进样分析，记录峰面积，计算5-O-甲基维斯阿米醇苷、蔓荆子黄素、羌活醇、异欧前胡素、甘草酸铵、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积的RSD值分别为2.85%、1.91%、0.92%、2.53%、0.67%、2.01%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.5.5 重复性实验 取同一批物质基准供试品溶液6 份，按“2.1”项下的色谱条件进样分析，记录峰面积，计算5-O-甲基维斯阿米醇苷、蔓荆子黄素、羌活醇、异欧前胡素、甘草酸铵、二氢欧山芹醇当归酸酯含量的RSD值分别为2.86%、1.60%、0.76%、0.71%、0.81%、0.89%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率实验 取上述重复性实验已测定各指标成分含量的同批次QSD 物质基准冻干粉适量，精密称定，分别以指标成分含量的50%加入各指标成分对照品储备液各6 份，按“2.4”项下的方法制备供试品溶液。按“2.1”项下的色谱条件进样测定，计算各指标成分的回收率。结果如表1所示，各指标成分平均加样回收率均在95%～105%，RSD在0.77%～3.69%，结果表明加样回收率良好。

2.6 15 批QSD 物质基准指标成分含量及饮片-物质基准转移率测定 采用“2.4”项下的方法分别制备15 批物质基准供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定15 批物质基准中各指标成分的含量，各饮片按照《中华人民共和国药典》2020年版进行含量测定[4]，按公式“转移率（%）=[物质基准中指标成分含量（mg/g）]÷[对应批次饮片中指标成分含量（mg/g）]×100%”计算各指标成分饮片到物质基准的含量转移率，结果见表3 及表4。

表4 饮片-物质基准中甘草酸铵、蔓荆子黄素、二氢欧山芹醇当归酸酯转移率%

由表3、表4 结果可知，15 批物质基准中指标成分5-O-甲基维斯阿米醇苷含量为1.27～2.81 mg/g，平均转移率为77.60%，转移率均值的±30%为54.32%～100.88%；羌活醇含量为1.09～1.70 mg/g，平均转移率为16.82%，转移率均值的±30%为11.77%～21.87%；异欧前胡素含量为0.03～0.28 mg/g，平均转移率为1.44%，转移率均值的±30%为1.01%～1.87%；甘草酸铵含量为12.74～33.78 mg/g，平均转移率为54.86%，转移率均值的±30%为38.40%～71.32%；蔓荆子黄素含量为0.09～0.59 mg/g，平均转移率为9.30%，转移率均值的±30%为6.51%～12.09%；二氢欧山芹醇当归酸酯含量为0.06～0.20 mg/g，平均转移率为8.93%，转移率均值的±30%为6.25%～11.60%。

3 讨论

3.1 含量测定及指标成分的选择 中药有效成分作为中药的药效物质基础，其选择及确定是中药复方及单味药材质量控制的重要过程，含量测定指标成分的选择不仅要符合《中华人民共和国药典》2020年版[4]的规定，还要确保其在相应的饮片、物质基准及复方能够实现可靠稳定的质量控制。本方选取的指标成分羌活醇、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草酸铵、蔓荆子黄素、5-O-甲基维斯阿米醇苷均为《中华人民共和国药典》2020年版[4]中羌活、独活、甘草、蔓荆子、防风药材的含量测定成分，均为专属性成分，且对于他们的药理作用有明确的文献报道[5-16]。独活、甘草在《中华人民共和国药典》2020年版中含量测定的成分还有蛇床子素、甘草苷，进行专属性实验时在独活阴性中有干扰；甘草苷出现峰形不好、不易分开等现象，故蛇床子素与甘草苷没有作为指标成分进行测定。《中华人民共和国药典》2020年版中藁本、川芎的含量测定成分均为阿魏酸，无法作为专属性指标成分，且藁本、川芎的化学成分相似[17-18]，经实验研究，未在藁本、川芎中找到专属性成分。

3.2 色谱条件及样品处理方法的考察 本实验前期对含量测定色谱条件的不同流速（0.7、0.8、0.9mL/min）、不同柱温（30、35、40 ℃）、不同比例的流动相进行梯度洗脱，考察色谱图出峰个数、峰形及分离度情况。结果表明流速为0.8 mL/min、柱温为30 ℃时，各峰形较好，分离度较好，整体基线较平稳。对样品的处理方法考察了不同比例甲醇、乙腈和纯水的提取溶剂，不同超声功率及超声时间，以色谱图整体峰形及分离度结果确定了60%甲醇复溶、超声功率320W、超声45 min 的样品处理方法。

3.3 物质基准各指标成分的含量及量值传递分析 根据《古代经典名方中药复方制剂的申报资料要求（征求意见稿）》中的指导建议，出膏率、指标性成分含量转移率应在均值±30%的波动范围内。结果提示15 批物质基准的平均出膏率为31.86%，RSD为3.77%，均未出现离散数据（平均值的70%～130%以外）。指标成分5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵、二氢欧山芹醇当归酸酯转移率均在均值±30%内；异欧前胡素转移率中S5、S15 批次超出范围；蔓荆子黄素转移率中S2、S5、S9、S14 批次超出范围；羌活醇转移率中S1、S4、S9、S13、S14、S15 批次超出范围。分析其原因发现不同批次饮片中羌活醇、异欧前胡素、蔓荆子黄素含量差异较大，导致多批次饮片-物质基准转移率超出范围；中药成分复杂，中药复方中各成分相互作用、相互影响也是造成指标成分转移率波动范围较大的原因之一；15 批QSD 物质基准各指标成分含量范围较大，组成QSD 物质基准的饮片含量差异较大，15 批QSD 物质基准的原料来自不同产地，导致其各项指标成分含量差异较大。所以在以后的研究中，要确保选取药材的来源和质量稳定，进行药材道地产地和主产地之间指标含量等质量的差异分析，选择一定的含量范围，以此初步选定药材产地，除此之外投料的均一性也是保证含量稳定的重要条件[19]。建议剔除离散程度较大的批次数值，后续研究增加物质基准研究批次，严格控制饮片的质量波动，以保证不同批次物质基准的质量相对稳定，降低离散值的影响，以期建立更加具有代表性的物质基准相关质量标准。

4 结论

本实验通过制备15 批QSD 物质基准冻干粉，建立其含量测定方法，测定专属成分羌活醇、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草酸铵、蔓荆子黄素、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量并进行饮片到物质基准量值传递分析，建议在后续的研究中严格把控投料饮片的质量情况，以期为经典名方QSD 后续物质基准与制剂研发的一致性和稳定性提供依据。