基于UPLC-QE-HF-MS/MS技术分析红凉伞化学成分及入血成分 Δ

石 慧 ，李 晓 周 英 丁晶鑫 刘 畅 刘雄伟 董 秀 ，陈 贇 俸婷婷 （.贵州中医药大学药学院，贵阳 55005；.贵州中医药大学药食两用资源应用与开发研究中心，贵阳 55005；3.贵州中医药大学纳米药物技术研究中心，贵阳 55005；.贵州三力制药股份有限公司，贵州 安顺 5600）

红凉伞是紫金牛科紫金牛属植物红凉伞Ardisia crenataSims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen 的干燥根及根茎，是壮族、瑶族常用民间草药[1—2]。红凉伞具有祛风除湿、清热解毒、止咳平喘等功效，常用于治疗跌打损伤、关节疼痛、扁桃体炎、咽喉肿痛、腰背痛等[3—4]。红凉伞中主要化学成分有三萜皂苷类、黄酮类、香豆素类和酚酸类等多种成分[5—6]，现代药理学研究表明其具有抗病毒、抗肿瘤、防治心脑血管疾病及抑制乳腺癌转移等作用[7—8]。但红凉伞治疗疾病的药效物质基础尚不明确，且关于红凉伞的化学成分研究较少。基于中药血清药物化学理论，中药真正发挥功效的活性成分与其所含的固有成分往往不同，只有从血中发现直接作用的活性物质并追溯其前体化合物才能真正阐明中药发挥临床疗效的药效物质基础[9]。因此，本研究采用可以高效、快速得到目标分析物的分子离子峰和碎片离子等信息的超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-QE-HF-MS/MS）对红凉伞的化学成分进行分析，同时依据中药血清药物化学理论对其入血成分进行分析，以期为红凉伞药效物质基础研究提供参考，为建立科学的用药依据和质量控制方法提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括Thermo Vanquish 型超高效液相色谱仪、Thermo Q-Exactive HF/MS 四极杆串联高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），JP2-160型万分之一电子天平（日本Chyo公司），XS205型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司），SB-600DTY 型超声波清洗器（宁波新芝生科技股份有限公司），MTN-2800D 型氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

红凉伞药材于2019年10月采集于贵州省凯里市雷山县雷公山，并经贵州中医药大学药学院魏升华教授鉴定为紫金牛科紫金牛属红凉伞A.crenataSims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen 的干燥根及根茎。对照品岩白菜素（批号PS000991）、朱砂根皂苷A（批号PS011516）、丁香酸（批号D-019-180426）均购于成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均≥98%；甲醇、乙腈、甲酸为质谱级，水为超纯水。

1.3 动物

本研究所用动物为健康雄性清洁级SD 大鼠，共12只，体重（200±20） g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0014。本研究动物实验符合贵州中医药大学实验动物伦理委员会审查批准要求（批准号为20210169）。

2 方法

2.1 红凉伞提取物的制备

称取红凉伞药材250 g，加10 倍量水（mL/g）煎煮2次，每次2 h，趁热过滤，合并滤液。将滤液经旋转蒸发仪浓缩，真空干燥备用，得率为33.90%。

2.2 供试品溶液的制备

取相当于0.2 g 生药材质量的提取物细粉，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定质量；超声（功率180 W，频率40 kHz）处理40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，收集续滤液。精密量取续滤液5 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜至进样杯中，供UPLC-QE-HF-MS/MS分析。

2.3 对照品溶液的配制

精密称取岩白菜素、朱砂根皂苷A、丁香酸对照品约10 mg分别至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得质量浓度为1 mg/mL 的储备液。分别精密量取上述对照品储备液各500 μL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，得混合对照品溶液。

2.4 分组、给药及取材

大鼠适应性喂养1 周后，采用配对比较法将其随机分为空白组和红凉伞给药组，每组6只。实验期间，空白组大鼠自由摄食饮水，给药组大鼠灌胃“2.1”项下制备的提取物（生药质量浓度为0.5 g/mL），给药剂量为5 g/kg（约等于10倍成人临床等效剂量），每天上、下午各给药1次，连续3 d。第4天上午再次给药1 h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠（2.25 mL/kg）对大鼠进行麻醉。腹主动脉取血，静置30 min，低温、低速离心（4 ℃，4 000 r/min，15 min），收集上清液，立刻冻存于－80 ℃冰箱中，供后续处理分析。

2.5 血清样品处理

取空白组和红凉伞给药组大鼠血清各200 µL，分别加入3 倍量甲醇，涡旋混匀，在4 ℃下以10 000 r/min 离心15 min，取上清液至EP管中，以37 ℃氮气吹干。残渣加入100 μL 甲醇复溶，涡旋2 min，溶解，在4 ℃下以14 000 r/min 离心15 min，取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得待测血清样品。

光敏电阻，是利用半导体的光电效应制成的一种电阻，其阻值随入射光的强弱而改变，具有以下特点：光谱响应宽；测试光强范围宽，即可对强光响应，也可对弱光响应；无极性区分，使用方便，成本低，寿命长；灵敏度高，工作电流大，可达数毫安[2]。

2.6 检测条件

2.6.1 色谱条件

采用Agilent Zorbax Eclipse C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，5%A；2～7 min，5%A→30%A；7～12 min，30%A→78%A；12～14 min，78%A；14～18 min，78%A→95%A）；柱温为30 ℃；流速为0.3 mL/min；进样量为2 μL；自动进样器温度为4 ℃。

2.6.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），在正、负离子模式下检测；加热器温度为325 ℃；鞘气压力为45 arb，辅助气压力为15 arb，吹扫气压力为1 arb；电喷雾电压为3.5 kV；毛细管温度为330 ℃；S-Lens RF Level 为55；扫描模式为一级全扫描（full scan，m/z100→1 500）与数据依赖性二级质谱扫描（dd-MS2，Top N＝10）；分辨率为70 000（一级质谱）、17 500（二级质谱）；碰撞模式为高能量碰撞解离模式。

2.7 红凉伞化学成分及入血成分分析

取红凉伞供试品溶液、含药血清样品、空白血清样品，按“2.6”项下条件进行UPLC-QE-HF-MS/MS 分析，记录图谱信息。使用Compound Discoverer 3.0 软件进行保留时间矫正、峰识别、峰提取等工作，根据二级质谱信息，利用Thermo mzCloud 在线数据库、Thermo mz-Vault 本地数据库，并参照有关文献和对照品质谱信息，初步鉴定红凉伞化学成分及入血成分。

3 结果

3.1 红凉伞提取物化学成分鉴定

对红凉伞样品的质谱数据进行分析可知，从红凉伞提取物中共鉴定出34个化合物，其中包括香豆素类化合物4个、黄酮类化合物5个、黄酮苷类化合物1个、有机酸类化合物3个、酯类化合物4个、酚类化合物3个、皂苷类化合物2个、氨基酸类化合物3个、脂肪酸类化合物3个、其他类化合物6 个，详见表1。红凉伞样品的总离子流图见图1。

表1 红凉伞提取物中化学成分鉴定结果

图1 正、负离子模式下红凉伞提取物的总离子流图

3.2 主要化合物结构解析

本研究以化合物8为例进行鉴定分析。在负离子模式下，化合物8的保留时间为4.556 min，准分子离子峰为m/z327.072 2[M－H]－，分子式为C14H16O9。二级质谱信息中，首先，母离子丢失1分子－CH2O，得到碎片离子m/z297.332 8[M－H－OCH2]－，进一步丢失1分子－CH2OH和1分子－OH，得到碎片离子m/z249.040 2[M－HOCH2－CH2OH－OH]－，再丢失2分子H2O，得到碎片离子m/z213.936 7[M－H－OCH2－CH2OH－OH－2H2O]－；或者在丢失1分子－CH2O的基础上，丢失1分子－CH2OH和1分子－CHO，得到碎片离子m/z237.039 5[M－HOCH2－CH2OH－CHO]－，进一步丢失1分子CO2，得到碎片离子m/z193.013 4[M－H－OCH2－CH2OH－CHOCO2]－。其中，最强的碎片离子峰是母离子丢失1分子－C4H8O4得到碎片离子m/z207.029 3[M－H－C4H8O4]－，进一步丢失1分子－CH3得到碎片离子m/z192.005 9[M－H－C4H8O4－CH3]－，再通过内酯环裂解与氢位移，得到碎片离子m/z154.388 5[M－H－C4H8O4－CH3－C2O+H]－。根据碎片信息、对照品比对及文献报道[10]，推测该化合物为岩白菜素，其可能裂解途径见图2。

图2 岩白菜素的质谱裂解途径

3.2.2 黄酮及其苷类化合物的鉴定

本研究从红凉伞提取物中共鉴定了6个黄酮及其苷类化合物，主要结构类型为黄酮醇类及糖苷类等，本研究分别以化合物19和化合物14为例进行鉴定分析。

在负离子模式下，化合物19 的保留时间为6.663 min，准分子离子峰为m/z301.035 4[M－H]－，分子式为C15H10O7。母离子分别通过黄酮类化合物的2 种经典裂解途径——RDA裂解和裂解途径Ⅱ裂解，得到碎片离子m/z151.002 8[M－H－C8H6O3]－和m/z107.012 6[MH－C9H6O5]－，其均为黄酮类化合物的特征碎片离子。准分子离子峰m/z301.035 4[M－H]－再丢失1分子－C8H3O5得到碎片离子m/z121.028 4[M－H－C8H3O5]－。根据碎片离子信息及文献报道[11]，推测该化合物为黄酮类化合物槲皮素，其可能裂解途径见图3。

图3 槲皮素的质谱裂解途径

在正离子模式下，化合物14 的保留时间为5.840 min，准分子离子峰为m/z611.160 7[M+H]+，分子式为C27H30O16。母离子首先丢失1 分子鼠李糖（Rha）得到碎片离子m/z465.102 5[M+H－Rha]+，再丢失1分子葡萄糖（Glc）生成m/z303.049 6[M+H－Rha－Glc]+，再进一步丢失1 分子－CO 和2 分子－OH 获得碎片离子m/z242.102 1[M+H－Rha－Glc－CO－2OH]+。根据碎片信息及文献报道[12]，推测其为黄酮苷类化合物槲皮素3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖苷，其可能的裂解途径见图4。

图4 槲皮素3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖苷的质谱裂解途径

3.2.3 有机酸类化合物的鉴定

在红凉伞提取物中找到较多有机酸类化合物，此类化合物结构相对简单，多为苯环连接－OH、－OCH3、－COOH等基团。

本研究以化合物7为例进行鉴定分析。在正离子模式下，化合物7 的保留时间为4.547 min，准分子离子峰为m/z199.060 0[M+H]+，分子式为C9H10O5。母离子脱去1分子H2O生成碎片离子m/z181.049 4[M+H－H2O]+；或者失去1 分子CO2获得碎片离子m/z155.070 1[M+HCO2]+，在此基础上再失去1分子－CH3获得碎片离子m/z140.046 7[M+H－CO2－CH3]+，继续丢失1 分子－OH 获得m/z123.044 2[M+H－CO2－CH3－OH]+，再丢失1 分子－CO生成碎片离子m/z95.049 6[M+H－CO2－CH3－OH－CO]+。根据碎片离子信息、对照品比对及文献报道[8]，推测该化合物为丁香酸，其可能裂解途径见图5。

图5 丁香酸的质谱裂解途径

3.3 红凉伞入血成分鉴定

本研究首先通过空白血清扣除大鼠血液中物质对药材入血成分分析的影响，然后通过对比含药血清、空白血清以及红凉伞药材提取物的质谱信息，根据色谱峰保留时间、质谱裂解规律及与对照品的比较，共鉴定出5个入血成分，分别为L-焦谷氨酸、丁香酸、岩白菜素、朱砂根皂苷A、麦考酚酸，详见表2。正、负离子模式下大鼠空白血清及含药血清的总离子流图见图6。

表2 红凉伞提取物入血成分鉴定结果

图6 正、负离子模式下大鼠空白血清及含药血清的总离子流图

3.4 对照品验证

在红凉伞提取物的化学成分及入血成分中，岩白菜素、丁香酸和朱砂根皂苷A这3个成分均有检出。因此，本研究选择岩白菜素、丁香酸和朱砂根皂苷A的对照品进行化合物验证。将红凉伞提取物中这3个成分的二级质谱图与各相应对照品的二级质谱图进行镜像比对，发现两者的碎片离子大量重合，基本可以确定为同一化合物，验证了本研究数据的准确性。本研究以岩白菜素的二级质谱图为例进行结果展示，详见图7。

图7 岩白菜素二级质谱图比对镜像图

4 讨论

本研究采用UPLC-QE-HF-MS 技术结合中药血清药物化学理论，鉴定出了红凉伞提取物中的34个化学成分，并鉴定出5个原型入血成分，分别为L-焦谷氨酸、丁香酸、岩白菜素、朱砂根皂苷A、麦考酚酸。红凉伞的化学成分及入血成分主要为香豆素类、黄酮类、酚酸类及皂苷类成分。其中，岩白菜素为香豆素类化合物，具有抗炎镇痛、抗心律失常、抗肿瘤、抗氧化、促进睡眠等作用，同时其对呼吸系统、消化系统、免疫系统有一定影响[13]；丁香酸具有治疗白内障的作用[14]；麦考酚酸是有机酸类物质，具有抗肿瘤、抗癌、抗炎等作用[15—16]；朱砂根皂苷A 等三萜皂苷类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、增强免疫等药理作用[17]；L-焦谷氨酸及其衍生物具有较好的抑菌、抗氧化及抗炎作用[18]。

综上所述，L-焦谷氨酸、丁香酸、岩白菜素、朱砂根皂苷A 及麦考酚酸可以初步推测为红凉伞的药效物质基础，为后续研究奠定了基础。但中药化学成分复杂，部分化合物响应值较低，本研究检测及鉴定出的成分并不完全，研究结果具有一定局限性，后续还需进行深入研究。