核桃仁原位水解工艺优化及氧化稳定性研究

洪佳伟, 王爱琳, 肖柳柳, 李 闯, 朱西平, 钱森和, 赵世光, 薛正莲

(安徽工程大学生物与食品工程学院,芜湖 241000)

核桃(JuglansregiaL.)为胡桃科、胡桃属多年生乔木[1]。核桃植株环境适应性强,在国内广泛种植[2]。核桃不仅具有丰富的营养价值,其口味也深受广大消费者喜爱[3,4]。如今我国核桃的种植面积和产量均居世界首位。随着坚果炒货行业的发展,因坚果氧化酸败造成的损失愈发严重[5],为减少这类损失,目前,使用较为普遍的方式有气调包装[6]、保鲜剂处理[7]等。然而针对坚果变质采用的大部分抗氧化剂依然是化学合成的,所需成本较高并且不利于消费者选择,寻求安全、有效的天然抗氧化剂迫在眉睫[8-11]。

核桃仁含有大量优质蛋白,氨基酸种类丰富可作为一种优质的抗氧化肽源[12]。抗氧化肽具有强大的自由基清除能力,对脂质在氧化过程中受到的损伤具有保护作用[13,14]。目前用酶解法[15]水解脱脂核桃粕[16]及核桃分离蛋白[17]获得抗氧化肽的方法已非常成熟。同时已有研究通过测定储藏过程中核桃仁过氧化值等指标的变化,进行氧化稳定性研究[18]及货架期预测。但现有研究中,通过对核桃仁水解实现原位富集抗氧化肽,提高核桃仁储藏过程中氧化稳定性,延长货架期并提高储藏品质的研究相对较少。

本研究直接水解核桃仁,测定水解前后核桃仁脂质氧化诱导时间的变化进行氧化动力学分析,评价水解对其氧化稳定性的影响。对核桃仁加速氧化,以过氧化值为指标评价核桃仁氧化过程中品质的变化,结合油脂货架寿命与温度关系预测货架期,评价表面富集抗氧化肽对核桃仁货架期的影响,为延长核桃仁货架期提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料和试剂

去皮核桃仁;复配蛋白酶(胰酶)(4×103U/g)、菠萝蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(2×105U/g)、木瓜蛋白酶(6×105U/g);邻二氮菲、邻苯三酚、铁氰化钾等;其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器和设备

ST-600脂肪测定仪,真空冷冻干燥机,TGL-16G低温高速离心机,HO1-1A恒温磁力搅拌器,TU-1800紫外可见分光光度计,Rancimat 743型脂肪稳定测试仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 核桃仁水解液的制备

将一定量核桃仁加入锥形瓶后加入去离子水,最后加入适量酶液使锥形瓶内液体体积为40 mL。滴加稀酸、稀碱溶液调节pH至酶的最适pH。在摇床以220 r/min振荡酶解,酶解完成后灭酶(95 ℃水浴15 min),离心(4 ℃、15 000 r/min、30 min)收集上清液备用。

1.2.2 蛋白酶的筛选

为避免酸碱环境对核桃仁产生影响,选取最适pH在7附近的酶进行实验包括:复配蛋白酶(胰酶)、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。设置底物质量分数为10%、酶质量分数为0.5%其余条件均为酶的最适水解条件。通过水解度及抗氧化能力的测定确定最佳水解蛋白酶,4种酶的最适水解条件见表1。

表1 不同蛋白酶制剂及其最适反应条件

1.2.3 单因素实验

在4种蛋白酶中筛选出水解效果最好的酶即复配蛋白酶(胰酶),酶解核桃仁。

选择底物质量分数(10%、20%、30%、40%、50%)、酶质量分数(1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%)、酶解时间(0.25、0.5、1、2、3、4、5 h)和酶解温度(35、40、45、50、55、60 ℃)4个因素,以酶解产物抗氧化能力为指标优化核桃仁水解条件。

1.2.4 正交实验

根据单因素实验结果,对各因素分别挑取三水平,设计四因素三水平L9(34)正交实验。研究复配蛋白酶(胰酶)的酶质量分数(A)、底物质量分数(B)、水解温度(C)和水解时间(D)对抗氧化能力的影响,挑选出最优水解条件。L9(34)正交实验因素与水平设计见表2。

表2 L9(34)正交实验因素与水平设计

1.2.5 水解度测定

采用甲醛滴定法[19]测定水解度,测定时以标准稀碱滴定溶液的滴定量来计算水解度。取5 mL水解液上清液,加入25 mL去离子水混匀后滴加0.01 mol/L氢氧化钠标准滴定液调节pH至8.2并记录其消耗量记为V1。然后向其中加入10 mL中性甲醛溶液,混匀后使用氢氧化钠滴定液将混合液pH滴定至9.2,记录氢氧化钠溶液的消耗量记为V2。取30 mL去离子水重复上述实验作为空白对照,记录氢氧化钠的消耗量记为V0。水解度计算公式如下。

式中:c为氢氧化钠的浓度/mol/L;0.014为1 mL浓度为1.00 mol/L NaOH标准溶液相当于氮的质量/g;n为底物样品总氮质量/g。

1.2.6 羟自由基清除率的测定

羟自由基清除率的测定方法参考邻二氮菲-Fe2+氧化法[20]:将1 mL 1.5 mmol/L邻二氮菲溶液(热溶法)、2 mL 0.2 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、1 mL去离子水和1 mL 0.75 mmol/L 硫酸亚铁溶液混匀后加入1 mL体积分数为0.01% H2O2混匀。将试管置于37 ℃水浴锅内,恒温水浴45 min,于536 nm测吸光度记为A损伤 。以1 mL去离子水代替H2O2所得吸光度记为A未损伤 。以1 mL样液代替去离子水测得的吸光度记为A样。

羟自由基清除率的计算公式为:

式中:A样、A损伤、A未损伤分别为样品管、损伤管、未损伤管在536 nm下的吸光度。

1.2.7 超氧阴离子自由基清除率的测定

超氧阴离子自由基清除率测定参考邻苯三酚自氧化法[21]:取50 μL样液于1 cm比色皿中后加入Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)加入50 μL邻苯三酚溶液使得体系体积为3 mL,置于紫外-可见分光光度计测量,每30 s记录吸光度反应时长4 min。以第一次记录的吸光度记为A0样,最后一次记录的吸光度记为A末样。用Tris-HCl缓冲液代替样品液做空白记录反应始末的吸光度记为A0空和A末空。

式中:D1为超氧阴离子自由基清除率。

1.2.8 还原力的测定

还原力的测定[22],将1 mL水解液和2 mL 0.2 mol/L PBS(pH 6.6)、2 mL质量分数为1%的铁氰化钾溶液混匀水浴保温20 min。然后加入2 mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液以2 000 r/min离心10 min。离心完成后取上清液2 mL加入2 mL去离子水、0.5 mL质量分数为0.1%的三氯化铁溶液混匀静置10 min后于700 nm测吸光度。以样品吸光度和阳性对照吸光度的比值来判断还原力的强弱。

上述抗氧化测定实验均以1 mg/mL还原型谷胱甘肽作为阳性对照。

1.2.9 加速氧化实验

以上述实验所得最优水解条件对去皮核桃仁进行处理,水解完成后将核桃仁置于筛网轻微振荡沥干表面水分,置于45 ℃热风循环干燥箱烘干水分,待水含量分数处于3%左右时,以60 g每袋封装。采用Schaal烘箱法于60 ℃对去皮核桃仁进行加速储藏实验[23],分别于0、1、2、3、4、5、7、9 d取样。空白对照组除水解过程中不加酶液,剩余过程同样品组。

1.2.10 油脂的提取

由实验室前期所得以石油醚为有机溶剂,料液比为1∶5(m/v)进行油脂的萃取,将核桃仁从铝袋中取出后粉碎并过40目筛,混合后慢速振摇1 min后避光低温静置12 h,混合液在(60±2)℃水浴锅中水浴1.5 h除尽石油醚,所得油脂存于50 mL离心管避光低温备用。

1.2.11 过氧化值的测定

参考 GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》第一法。

1.2.12 氧化诱导时间测定

通过Rancimat 743油脂氧化测定仪测定油脂氧化诱导时间(OSI)。设置参数:温度110、120、130 ℃,氧气通量10 L/h,单次测试取3 g核桃油样品,于测量池中加入100 mL超纯水,通过水电导率的变化来测定氧化诱导时间。根据氧化诱导时间计算核桃油的氧化动力学参数。

1.2.13 货架期预测

以过氧化值为指标进行货架期预测,油脂氧化规律符合一级动力学模型。对加速氧化实验所得过氧化值数据进行拟合,预测其在(60±2)℃下达到GB 19300—2014《食品安全与国家标准坚果与籽类食品》中过氧化值的限定值对应的加速氧化时间。结合温度与油脂货架寿命的关系预测常温储藏时核桃仁货架期[24]。

1.2.14 数据处理

每个实验均设置3组平行,通过SPSS软件分析显著性,用origin 2018软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶制剂的筛选

由图1可知,在水解初期,复配蛋白酶(胰酶)酶解产物水解度显著上升,表明该蛋白酶对核桃仁敏感,水解能力较强。以3种抗氧化能力为指标时,复配蛋白酶(胰酶)水解液的抗氧化能力均远高于其他酶制剂水解液的抗氧化能力。结合4种指标将复配蛋白酶(胰酶)作为最优水解用酶进行后续实验。

图1 不同蛋白酶酶解对酶解产物水解度、还原力、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率的影响

2.2 单因素实验

2.2.1 底物质量分数对胰酶水解液的抗氧化活性影响

底物质量分数对水解液抗氧化活性的影响如图2所示。在底物质量分数处于0%～40%内,底物增加的同时各项抗氧化指标均相应增长且呈正相关性。在底物质量分数处于40%时,各项抗氧化指标均处于较高水平。当底物质量分数超过40%时,可能由于底物添加过多使得酶解液的流动性减弱,不利于酶的作用[25]。以底物质量分数为40%为最适底物浓度。以1 mg/mL还原型谷胱甘肽溶液为阳性对照,经测定其羟自由基清除率为56.52%、超氧阴离子自由基清除率为23. 14%,当只有底物存在时溶液几乎不存在抗氧化活性。

注:同一指标下不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著,下同。图2 底物质量分数对水解液抗氧化能力的影响

2.2.2 酶质量分数对胰酶水解液抗氧化活性的影响

由图3观察到外源添加胰酶使得水解液抗氧化能力上升显著,说明水解有利于产生可溶性抗氧化活性物质提升水解液的抗氧化能力。当酶质量分数处于5%～11%范围内,酶的加入使得水解液的抗氧化能力快速上升,说明在此范围内产生了大量的活性抗氧化物质。酶质量分数超过11%,水解液的抗氧化能力增长趋势减弱。结合抗氧化指标及成本,选择酶最优质量分数为11%。

图3 酶质量分数对水解液抗氧化能力的影响

2.2.3 酶解时间对胰酶水解液抗氧化活性的影响

酶解时间对水解液抗氧化活性的影响如图4所示。在水解0.0～0.5 h水解液的抗氧化能力快速上升。随着水解进程的延续,水解液抗氧化能力的增长趋势减缓。水解时间超过2 h后,水解液的3种抗氧化能力均下降且羟自由基清除力损失巨大,可能是由于水解时间过长导致初步水解产生的抗氧化活性物质进一步水解,生成了其他活性物质使得抗氧化活性下降。结合抗氧化指标及为减少水解时间过长对核桃仁品质产生不利影响,选取水解时间0.5 h为最佳水解时长。

图4 酶解时间对水解液抗氧化能力的影响

2.2.4 酶解温度对胰酶水解液抗氧化活性的影响

酶解温度对水解液抗氧化活性的影响如图5所示。当水解温度处于40～45 ℃范围,随着水解温度的提高水解液的抗氧化能力也在提高,一方面可能是因为在40～45 ℃内酶的活力随着温度的升高逐渐得到了提升;另一方面可能是由于温度升高,核桃蛋白中部分疏水性氨基酸暴露使酶解反应更加充分。当温度超过45 ℃后,水解液抗氧化能力随着温度的升高而减弱,可能是由于温度过高导致部分抗氧化活性物质失活。故选取45 ℃作为最适水解温度。

图5 酶解温度对水解液抗氧化能力的影响

2.3 正交实验结果与分析

由表3与表4可知,针对不同的抗氧化指标,各因素对其会产生不同程度的影响。根据抗氧化指标的极差值比较可知,对不同抗氧化指标在选定的酶解温度、酶质量分数、水解时间、底物质量分数中存在显著差异。对超氧阴离子自由基清除率,各因素影响程度的主次顺序为D>B>C>A,即酶解温度>酶质量分数>水解时间>底物质量分数;对于羟自由基清除率来说为D>A>C>B即酶解温度>底物质量分数>水解时间>酶质量分数、对还原力来说为B>D>A>C即酶质量分数>水解温度>底物质量分数>水解时间及对加权综合评分指标来说各因素的主次顺序为D>B>A>C,即水解温度>酶质量分数>底物质量分数>水解时间。综合评分的加权系数通过熵值法得出,熵值是一种物理计量单位,熵值法[26]通过熵值提供的信息效用值确定各指标所占权重,其中羟自由基清除率所占系数为0.394、超氧阴离子自由基清除率所占系数为0.286 9、还原力的系数为0.319。通过对综合评分的分析确定最优组合同时结合成本及水解液抗氧化能力的因素综合考虑以A2B2C2D2为实验最优组合。经3次平行实验验证,测得最优组合水解液的超氧阴离子自由基清除率为63.21%、羟自由基清除率为97.66%同时还原力为188.68%(1 mg/mL GSH吸光度作对比),相比于正交实验组均处于较高水平。

表3 L9(34)正交实验结果

表4 超氧阴离子自由基清除率极差分析表

2.4 氧化诱导时间的分析

对照组和样品组的OSI值,由Rancimat 743油脂氧化稳定性测定仪测得。当氧化温度从110 ℃加热到130 ℃,对照组和样品组核桃油的OSI值分别从2.18 h缩短到0.86 h、从2.4 h缩短到0.71 h。从所得数值上看,温度每升高10 ℃对应核桃油的氧化诱导时间缩短了一半左右。通过对lg OSI和(1/T)的关系作图,log OSI和1/T线性相关其中样品的方程式为Log OSI=4 057.087 38(1/T)-10.209 58,R2=0.996 6;对照的方程式为Log OSI=3 156.566 38(1/T)-7.931 58,R2=0.890 49。从Arrhenius方程出发,可得lnk=lnZ-Ea/RT其中k为OSI的倒数,R代表理想气体常数(8.314 kJ/mol),由此得回归方程的斜率和油样的氧化自由能(Ea)有关,截距和油样的频率因子(Z)有关。结合氧化诱导时间的数值得样品组方程为lnK=23.638 71-9 394.115 89/TR2=0.996 88,对照组为lnK=18.095 25-7 204.325 26/T,R2=0.886 81并由此得油样的Ea、Z及Q10。

经计算样品组Ea为78.103 kJ/mol ,Q10指数为1.832 3,而对照组Ea为59.896 kJ/mol ,Q10指数为1.598 8。Q10数值代表温度升高10 ℃导致的氧化速率的增加[27]。 Q10数值越高意味着反应速率发生一定变化所需的温度变化越小,说明温度对样品氧化反应速率的影响较大。通过Q10指数的计算解释了样品组从110 ℃升温到130 ℃ OSI值的变化比空白对照组大的原因。

Ea值的变化表明核桃仁经过直接酶解使得核桃油氧化稳定性得到提升。一般来说,Ea值越大,氧化速率发生一定改变所需的温度变化就越小,即Ea越大对温度的上升就越敏感。针对于油脂氧化反应,Ea越大说明油脂氧化所需的能量就越大,油脂氧化就越难进行。由表5可知,样品组Ea>对照组Ea。Ea值的变化说明了,用胰酶直接水解核桃仁产生的抗氧化活性物质增强了油脂在氧化过程中的稳定性,对延缓油脂氧化具有积极作用。

2.5 过氧化值的变化

由图6可知,在加速氧化过程中,对照组的过氧化值较样品组偏高。随着氧化时间的增加,两者间的差值也不断增加。表明相同氧化条件下,样品组在加速氧化过程中受到的氧化损伤显著低于对照组;样品组在储藏始末的过氧化值变化幅度相较于对照组来说小,表明样品组较对照组拥有更好的氧化稳定性,有助于核桃仁在加速氧化过程中保持较好的品质。对照组和样品组在储藏期内过氧化值均未超过GB 19300—2014 《食品安全与国家标准坚果与籽类食品》限定值0.08 g/100 g。

图6 不同处理加速氧化过程中过氧化值的变化情况

2.6 货架期预测

对加速储藏过程中测得的过氧化值进行拟合,得对照组:Y=0.010 09e0.198 57X,R2=0.915 89;样品组:Y=0.004 61e0.192 91X,R2=0.948 41。R2均大于0.9,表明拟合相关性及拟合精度较好。将国标规定的过氧化值的限定值分别代入方程得60 ℃下对照组和样品组储藏时间分别为10.5 d和14.8 d。由温度和油脂货架寿命系数关系[28]知油脂在60 ℃烘箱中储存1 d相当于在20 ℃储藏16 d,由此推算对照组和样品组在20 ℃的货架期分别为168 d和236.8 d。通过水解核桃仁原位富集抗氧化肽使得核桃仁的货架期延长了68.8 d。

3 结论

为了延长核桃货架期,本研究对核桃仁整体酶解原位富集抗氧化肽,测定核桃油氧化诱导时间,结合氧化动力学研究该工艺对核桃仁油脂氧化稳定性的影响。测定加速氧化过程中氧化指标的变化,说明该工艺对核桃仁氧化品质的影响。结果表明:酶解后核桃油具备了较高的Q10,其氧化自由能从59.896 kJ/mol上升到78.103 kJ/mol,获得了较高的氧化稳定性;在加速氧化过程中对照组的过氧化值始终高于样品组,两组分间的差值也在逐渐增加。结合温度和油脂货架寿命系数关系,得出直接水解原位富集抗氧化肽使得核桃仁货架期延长了68.8 d。本研究通过对核桃仁进行整体酶解,提升了核桃仁的氧化稳定性,有效延长了核桃仁货架期,为寻找绿色、安全、有效的核桃储藏方式提供技术参考。