过硫酸氢钾对贝类育苗水体中溶藻弧菌的杀灭效果

陈金华 福州市长乐区漳港海蚌场 福州 350209

弧菌是导致海水养殖中细菌类疾病最主要的病原之一，弧菌分布范围广，发病率高，影响率大，给养殖产业带来不可预估的危害， 近些年来对于弧菌的研究成为新一大热点[1]。 《伯杰氏系统细菌学手册》第九版中，弧菌属共收录了35 种细菌，其中很大一部分被认为是海水养殖中的重要致病菌[2]，例如鳗弧菌（Vibro anguillarum）、创伤弧菌（V.vulnificus）、溶藻弧菌 （V.alginolyticus）、 副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、最小弧菌（V.mimicus）、鲨鱼弧菌（V.carchariae）等众多弧菌引起鱼虾类疾病，其中能够对虾引发疾病的弧菌有鳗弧菌、 创伤弧菌、 溶藻弧菌、副溶血弧菌等[3]。

弧菌不仅可以对海水养殖产品造成危害， 误食后对人体也会造成一定的影响。 如副溶血弧菌可引起急性肠胃炎，河弧菌可引起散发性腹泻，创伤弧菌可以引起败血症。 在沿海地区导致食物中毒和腹泻的主要病原为溶藻弧菌[4]， 溶藻弧菌是革兰氏阴性菌，属于弧菌科弧菌属，弯杆状、无荚膜，在TCBS 培养基上呈现黄色菌落。 溶藻弧菌广泛分布在世界各地海水及河口区，其数量占据海水类弧菌榜首，养殖贝类、虾类感染溶藻弧菌的概率远大于养殖鱼类，也是西施舌（Coelomactra antiquata）育苗生产中影响浮游幼虫、稚贝发育存活的重要因素。

在水产养殖过程中广泛使用消毒剂来控制细菌性疾病， 最常使用的消毒剂有次氯酸钠、 漂粉精、聚维酮碘、戊二醛、二氯异氰尿酸钠等[5]，大多数为含酸、碱、卤类、氧化剂、重金属等[6]，易对水源、土壤造成影响， 进而对人们的生活与健康带来不良的影响[7]。

过硫酸氢钾（KHSO5，PMS），为一种无机过氧化物，易发生吸潮迅速分解成氧气和硫酸钾，工业上将PMS 与硫酸氢钾、硫酸钾制成过硫酸氢钾复合盐进行使用，其稳定性高、易保存。一方面，过硫酸氢钾可以与水发生氧化反应，生成不稳定的臭氧（O3），臭氧迅速分解形成氧气和新生态氧， 能够杀灭呼肠孤病毒（GCRV)、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、无乳链球菌（Streptococcaceae agalactiae）等水产养殖病原微生物[8]；另一方面，由于过硫酸氢钾分解后产生的硫酸根自由基（SO4-·）具有极强的氧化性，能够迅速破坏微生物细胞膜的通透性， 从而使细胞内容物流出，并且可以与核酸中的金属离子结合，产生自由基， 作用于磷酸二脂键并使其断裂， 也能达到抑制细菌生长的作用[9]。 过硫酸氢钾反应生成CO2、H2O、SO42-等产物过程中不生成有害的物质，相较于其他消毒剂而言更加绿色环保[10]。 对于过硫酸氢钾的研究主要集中在对于水处理应用中， 例如水体中藻毒素的去除、 含氯酚废水的降解及燃料废水的降解， 在对饮用水的消毒上也是远远高于传统的氧化剂[12]。 过硫酸氢钾对海水中溶藻弧菌的杀灭效果尚未见报道。

本研究在实验室条件下评价过硫酸氢钾对海水贝类育苗中常见致病菌溶藻弧菌的杀灭效果， 探究过硫酸氢钾对于溶藻弧菌最优的杀灭条件， 并进一步探讨该消毒剂在贝类育苗水体中的使用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 本试验使用的菌种为溶藻弧菌，溶藻弧菌从长乐区漳港海蚌场的西施舌育苗池海水中分离，获得试验菌种（ZHB201606053）。

1.1.2 试验材料 过硫酸氢钾复合盐 （CAS 号：37222-66-5）， 西陇科学股份有限公司产品；TCBS培养基、无菌海水。

1.1.3 试验器材 250 mL 烧杯、150 mL 锥形瓶、电子天平、称量纸、玻璃棒、封口膜、培养皿、紫外线超净台、酒精、涂布棒、恒温箱、200 uL 移液枪、1 mL 移液枪、10 mL 移液枪。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验 在实验室条件下探讨药物浓度、温度、菌液浓度和作用时间4 个单因子对过硫酸氢钾杀灭溶藻弧菌效果的影响。 设计试验条件分别为过硫酸氢钾药物浓度（10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L），温度（10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃）， 溶藻弧菌菌液浓度 （1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL），作用时间（0.5 h、1 h、6 h、12 h、24 h）。 试验组设6 个平行组，另设对照组，均在相应条件下摇床培养， 取样涂布TCBS 固体平板检测各组弧菌生长情况，计算杀菌率。 杀菌率=[1-（试验组弧菌菌落数/对照弧菌菌落数）]×100%。

1.2.2 正交试验设计 在过硫酸氢钾对溶藻弧菌单因素试验的基础上，通过正交试验探讨温度、菌液浓度、 药物浓度对过硫酸氢钾杀灭溶藻弧菌影响的最优条件。 将上述3 个因素按L9（34）正交表安排试验，试验因素与水平见表1。

表1 三因素三水平正交试验设计

1.2.3 过硫酸氢钾对西施舌育苗池水中弧菌的杀灭效果 按最终药物浓度为1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L、11 mg/L、13 mg/L、15 mg/L 的要求，将药液与过滤后的西施舌育苗池海水均匀混合后作为试验组，每组3 个平行，分别放入25 ℃、120 r/min摇床中分别培养1 h、6 h、12 h、24 h；另设对照组同时培养。

1.2.4 菌液制备 选取西施舌育苗池养殖池水分离出的溶藻弧菌单菌落接种于TCBS 固体培养基中，于37 ℃培养24 h，挑取正常的溶藻弧菌单菌落，用灭菌海水稀释刮取下的菌落， 经计数稀释制成不同菌液浓度的菌悬液供试验使用。

1.2.5 消毒剂溶液的配制 称取6 g 过硫酸氢钾复合盐溶于50 mL 无菌海水中， 配制出初始浓度为120 g/L 的过硫酸氢钾复合盐水溶液。根据正交试验方案所需的药物浓度， 再进一步使用无菌海水将浓度稀释至试验浓度。

1.2.6 杀菌率测定 37 ℃培养24 h 后的培养皿，计数平板的菌落数， 每个试验组的3 个平行培养皿取平均值。 采用SPSS19 软件处理数据，计算最终杀菌率。

2 结 果

2.1 不同浓度过硫酸氢钾对溶藻弧菌杀灭效果从表2、图1 可知，随着过硫酸氢钾药物浓度提升，对溶藻弧菌的杀菌率大幅度上升， 且各个梯度之间差异性显著。 在药物浓度为10 mg/L～30 mg/L 时，杀菌率均＜50%，而药物浓度达40 mg/L 时，杀菌率达到90%，过硫酸氢钾药物浓度与溶藻弧菌杀灭率之间存在明显的剂量效应。

图1 药物浓度对杀菌率的影响

表2 不同浓度过硫酸氢钾杀灭溶藻弧菌试验结果

2.2 温度对过硫酸氢钾杀灭溶藻弧菌效果的影响温度是影响消毒剂效果的重要因素之一，从表3、图2 可知，当温度小于20 ℃时，杀菌率随着温度的上升而逐步提高，15 ℃与20 ℃的杀菌率有显著差异；20～30 ℃杀菌率最高，但无显著差异。因此，20～25 ℃是过硫酸氢钾对溶藻弧菌杀灭效果最适的温度范围。

图2 温度对杀菌率的影响

表3 不同温度下过硫酸氢钾杀灭溶藻弧菌试验结果

2.3 过硫酸氢钾对不同菌液浓度溶藻弧菌的杀灭效果 从表4、图3 可知，随着溶藻弧菌菌液浓度升高， 过硫酸氢钾的杀菌作用逐渐减弱， 但104CFU/mL～106CFU/mL 杀菌率差异并不显著； 菌液浓度106CFU/mL 与108CFU/mL 的杀菌率随着菌液浓度升高而大幅降低，且差异显著。

图3 菌液浓度对杀菌率的影响

表4 不同菌液浓度下过硫酸氢钾杀灭溶藻弧菌实验结果

2.4 过硫酸氢钾作用时间对溶藻弧菌杀灭效果的影响 从表5、 图4 可知， 过硫酸氢钾的作用时间0.5 h 至6 h 的杀菌率差异不显著，而与12 h 杀菌率差异显著。表明过硫酸氢钾杀菌反应迅速，能在较短时间内杀灭溶藻弧菌，在生产应用中潜力巨大。

图4 作用时间对杀菌率的影响

表5 不同作用时间对过硫酸氢钾杀灭溶藻弧菌的影响

2.5 温度、菌液浓度和药物浓度对溶藻弧菌杀灭率的联合影响 正交试验结果见表6、图5，其中试验5 组与试验7 组的杀菌率均为100%。

图5 正交试验结果

表6 三因素三水平正交试验结果

为了探究试验最优条件， 将试验结果输入至SPSS19，得出各个单因素的影响情况以及方差结果分析（见表7）。 方差分析中，当P＞0.05 时，该因素效果不显著；当0.01＜P＜0.05 时，该因素效果显著；当P＜0.01 时，效果极显著。 从表8 可知，温度的方差为0.040，处于0.01～0.05，效果显著；菌液浓度的方差为0.060，大于0.05，则菌液浓度对溶藻弧菌的影响不显著；药物浓度的方差为0.003，小于0.01，可见过硫酸氢钾药物浓度对于溶藻弧菌的杀灭效果极其显著。因此，能够抑制溶藻弧菌的主次因素分别为药物浓度、温度、菌液浓度。从表8 的均值可知，过硫酸氢钾对溶藻弧菌杀灭作用的最优水平组合为药物浓度40 mg/L、温度25 ℃、菌液浓度105CFU/mL。

表7 影响杀菌率因素的方差分析结果

表8 杀菌率单因素统计

2.6 过硫酸氢钾对西施舌育苗池水中弧菌的杀灭效果 从表9 杀菌率结果来看， 过硫酸氢钾浓度为5 mg/L 以下时，不能抑制弧菌的生长，弧菌数量反而有一定程度增加，之后随着浓度增加，弧菌得到一定程度的抑制。当药物浓度达11 mg/L 时，灭菌率达99%；药物浓度大于13 mg/L 时，弧菌完全被杀灭；药物浓度大于9 mg/L 时， 药物作用时间1～24 h 的杀菌率差异均不显著， 表明过硫酸氢钾药效可以维持24 h。

表9 不同浓度过硫酸氢钾对西施舌育苗池水弧菌的抑制效果

3 讨 论

水产养殖育苗生产中水源的杀菌消毒是预防细菌病害的重要措施， 不同消毒剂和过高的药物浓度可能导致水体中的残留， 影响养殖苗种的生存和发育，过硫酸氢钾杀菌反应过程中不生成有害的物质，反应后的产物相较于其他消毒剂而言更加绿色安全，在水产养殖业中有良好的应用前景。研究结果显示， 过硫酸氢钾复合盐对溶藻弧菌具有显著的杀灭效果， 对于杀菌率影响最大的则为过硫酸氢钾药物浓度和温度， 有效消毒需综合考虑适宜的药物浓度和温度条件，过硫酸氢钾在20 ℃即表现出很好的杀菌效果， 在海水中杀菌时间短至0.5 h均有明显杀菌作用， 是常用的次氯酸钠等含氯消毒剂无法匹敌的[11]。

过硫酸氢钾的氧化能力超过了氯化物、 高锰酸钾、过氧化氢等，而且相较于其他消毒剂来讲更加卫生与环保，且其对皮肤以及粘膜的刺激较为温和，杀菌作用的效果更加持久， 分解后的产物硫酸盐可以通过人体、 动物体的肝脏以及泌尿系统很好地排出体外[12]，不仅不会对身体造成危害，排出的废物也不会对环境产生有害的残留，因此被誉为“氧化性和安全性完美结合的过氧化物”[13]。 因此，将过硫酸氢钾应用于水产养殖用水的消毒是非常安全、绿色、环保的。以过硫酸氢钾复合盐为主，辅以有机酸、无机酸、表面活性剂等组合而成的新型过氧化物类消毒剂，可大大降低使用浓度，适合水产养殖场景，将为水产养殖提供一种新的绿色环保的消毒方式。