圣草酚对角质形成细胞和黑色素瘤细胞共培养体系中黑色素合成的促进作用

古丽切合热·依布拉音,李艳红,塔吉古丽·阿不里克木,付建红,阿迪拉·吐尔逊塔依

(新疆师范大学生命科学学院 新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室 干旱区植物逆境生物学实验室,新疆 乌鲁木齐 830054)

白癜风(vitiligo)是一种不明原因引起的色素脱失性皮肤疾病,病程长、易复发,临床特征为皮肤、黏膜出现白色斑片及毛发变白,发病率为0.5%～2.0%,目前仍没有安全有效的治疗方法。白癜风虽然不危害生命,但其突发的容貌变化和慢性病程往往会给患者带来心理压力,降低生活质量[1]。因此,很有必要探索安全有效的新型药物。

由于黑色素细胞能够直接反映黑色素与白癜风之间的关系,因此对白癜风发病机制和治疗的研究重点往往集中于黑色素细胞,而忽略了角质形成细胞(HaCaT)的重要性。研究表明,HaCaT细胞在黑色素细胞的凋亡过程中扮演着重要角色[2]。HaCaT细胞是人体表皮细胞中数量最多的细胞,约占80%,与黑色素细胞存在直接或间接相互作用,影响黑色素细胞的增殖、分化、凋亡和功能[3-4]。自1988年Halaban首次成功建立HaCaT细胞和黑色素细胞体外共培养体系以来,因其能够较好地模拟皮肤的生理状况而被众多学者广泛采用并改进,进行了HaCaT细胞和黑色素细胞的相互作用、色素的转移和分布、移植治疗白癜风、筛选和验证药物等研究。

圣草酚(eriodictyol),又名北美圣草素,化学名3′,5,4′,7-四羟基黄酮烷,单体为淡黄色结晶粉末,易溶于甲醇,是具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[5-6]的天然黄酮类化合物。作者所在课题组前期研究发现,驱虫斑鸠菊[Vernoniaanthelmintica(L.) Willd]黄酮类组分中主要成分紫铆素、紫铆因、圣草酚及甘草素对氧化应激损伤的HaCaT细胞有保护作用,其中圣草酚的保护作用最强。因此,作者在此建立HaCaT细胞和黑色素瘤细胞(B16)体外共培养体系,分别采用MTT法测定细胞增殖率、多巴氧化速率法测定细胞酪氨酸酶激活率、氢氧化钠裂解法测定细胞黑色素合成率、实时荧光定量PCR法测定酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白1(TRP-1)、酪氨酸相关蛋白2(TRP-2)的基因相对表达量,以进一步研究圣草酚对黑色素合成的影响。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

HaCaT细胞、B16细胞,中国科学院上海细胞库;DMEM完全培养基,美国BI公司;MEM完全培养基,武汉普诺赛生命科技有限公司。

圣草酚(纯度≥98%,色谱纯)、MTT试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂、DEPC水,索莱宝生物科技有限公司;胎牛血清、双抗/青链霉素合剂、胰蛋白酶、PBS缓冲液,美国BI公司;DMSO、L-DOPA,美国Sigma公司;Trizol Reagent,美国Ambion公司;氢氧化钠、三氯甲烷、异丙醇,分析纯,成都科隆化工有限公司;cDNA 反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒,日本Takara公司。

SW-CJ-2FD型超净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;BDS400型倒置显微镜,重庆奥特光学仪器有限责任公司;MCO-20AIC型细胞培养箱,日本SANYO;液氮生物容器,成都液氮容器厂;L-550型台式低速离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司;Fresco21型超低温高速离心机、1530型酶标仪,芬兰Thermo;BCD-215KS型-20 ℃冰箱,海尔;MDF-U880V型-80 ℃冰箱、SIM-F140BDL型制冰机,日本Panasonic;TC20型细胞计数仪,美国Bio-Red;DHP-9272型电热恒温培养箱,上海一恒科技有限公司;MK2000-2型干式恒温器、Nano-400A型超微量核酸分析仪,杭州奥盛仪器有限公司;FQD-96C型荧光定量PCR仪,杭州博日科技股份有限公司;无核酶枪尖、无核酶EP管、无核酶八连管,上海科进生物技术有限公司;细胞培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板、冻存管,无锡耐思生命科技股份有限公司。

1.2 细胞培养

从液氮生物容器中取出HaCaT细胞和B16细胞,立即置于37 ℃水浴锅中溶解,去除冻存液后,将HaCaT细胞接种于含有15%胎牛血清和1%双抗的MEM完全培养基,将B16细胞接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基;置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h,用倒置显微镜观察生长情况并定期更换新鲜的完全培养基;待贴壁细胞密度达到85%～90%时传代,选择对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 共培养体系的建立

按2∶1比例混合接种HaCaT细胞和B16细胞建立共培养体系[7-8]。取对数生长期的HaCaT细胞,用胰蛋白酶消化10 min,接种至直径10 cm的细胞培养皿中,使HaCaT细胞数量为6×105个,置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养6 h使细胞贴壁;取对数生长期的B16细胞,用胰蛋白酶消化1～2 min,接种至上述HaCaT细胞贴壁生长的培养皿中,使B16细胞数量为3×105个,置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养使细胞贴壁。

1.4 细胞增殖率的测定

在共培养体系中,实验组用完全培养基配制的浓度(μmol·L-1)分别为1.563、3.125、6.25、12.5、25、50、100的圣草酚干预,对照组(HaCaT细胞与B16细胞共培养体系)和空白组(不含细胞,只含相同体积的培养基)不加药,每组设置4个复孔;干预24 h后去除旧液,用PBS缓冲液清洗,每孔加入100 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)于37 ℃避光培养4 h;弃上清液,每孔加入100 μL DMSO溶液振荡10 min,使甲瓒完全溶解,用酶标仪测定490 nm处吸光度。按式(1)计算细胞增殖率(%):

(1)

1.5 细胞酪氨酸酶激活率的测定

在6孔板中建立共培养体系,实验组用浓度(μmol·L-1)分别为6.25、12.5、25、50的圣草酚干预,空白对照组(HaCaT细胞与B16细胞共培养体系)不加药,阳性对照组用50 μmol·L-1的8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)干预,阴性对照组用50 μmol·L-1的VC干预,每组设3个复孔;干预48 h后[9-10],收集样品,冰上操作吸弃培养基,用PBS缓冲液清洗2次,每孔加入100 μL RIPA裂解液,-80 ℃裂解30 min;在4 ℃溶解后,于4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min;取上清液10 μL用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度;取上清液90 μL转移至96孔板中,加入10 μL L-DOPA(10 mmol·L-1),于37 ℃孵育至浅棕褐色出现,迅速测定490 nm处吸光度。按式(2)计算酪氨酸酶含量,按式(3)计算酪氨酸酶激活率(%):

(2)

(3)

1.6 细胞黑色素合成率的测定

采用氢氧化钠裂解法测定细胞黑色素合成率。按1.5方法分组,干预48 h后,收集样品,冰上操作[11]吸弃培养基,用PBS缓冲液清洗2次,每孔加入100 μL RIPA裂解液;冰上裂解后转移至1.5 mL EP管中,4 ℃混匀40 min,于4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min;用BCA蛋白定量试剂盒测定上清液中蛋白浓度;沉淀中加入190 μL NaOH裂解液(4%NaOH,10%DMSO),80 ℃水浴1 h使黑色素溶解,上下颠倒数次,取150 μL测定405 nm处吸光度。按式(4)计算黑色素含量,按式(5)计算黑色素合成率(%):

(4)

(5)

1.7 TYR、TRP-1、TRP-2的基因相对表达量测定

采用实时荧光定量PCR法测定TYR、TRP-1、TRP-2的基因相对表达量。采用Trizol法提取细胞总RNA,用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(perfect real time)试剂盒进行cDNA的合成,操作均严格按说明书进行;用TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行实时荧光定量PCR分析,检测相关mRNA的表达。以GAPDH作为内参对照,用2-ΔΔCt方法计算并进行数据分析,所有引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

1.8 数据统计与分析

每组实验至少重复3次,结果以平均值±标准误差表示。用GraphPad Prism 8.0.2软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)。组间差异:P<0.05为差异显著;P<0.01为差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 圣草酚对共培养体系中细胞增殖的影响(图1)

图1 圣草酚对共培养体系中细胞增殖的影响(100×)Fig.1 Effect of eriodictyol on cell proliferation in co-culture system(100×)

由图1可见,与对照组比较,1.563～100 μmol·L-1圣草酚干预组的细胞数量增加,共培养体系中HaCaT细胞与B16细胞相互连接,B16细胞树突变长。

采用MTT法测定共培养体系中细胞增殖率,结果如图2所示。

注:与对照组比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001;其它图同。图2 圣草酚对共培养体系中细胞增殖率的影响Fig.2 Effect of eriodictyol on proliferation rate of cells in co-culture system

由图2可见,圣草酚在低浓度下对共培养体系中的细胞无毒性作用,而且有明显的促增殖作用;在圣草酚浓度为6.25 μmol·L-1时,细胞增殖率达到最高,为147.13%,与对照组比较,细胞增殖率极显著提高(P<0.001);在圣草酚浓度为100 μmol·L-1时,细胞增殖率为29.71%,对细胞毒性最大(P<0.0001);经计算,圣草酚半抑制浓度(IC50)为62.635 μmol·L-1。因此,选取浓度为6.25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1的圣草酚进行后续实验。

2.2 圣草酚对共培养体系中细胞酪氨酸酶活性的影响(图3)

图3 圣草酚对共培养体系中细胞酪氨酸酶激活率的影响Fig.3 Effect of eriodictyol on tyrosinase activation rate of cells in co-culture system

由图3可见,与空白对照组比较,12.5～50 μmol·L-1圣草酚对共培养体系中细胞酪氨酸酶活性有激活作用(P<0.001),并呈剂量依赖性。在圣草酚浓度为12.5 μmol·L-1时,酪氨酸酶激活率为132.31%;浓度为25 μmol·L-1时,酪氨酸酶激活率为135.21%;浓度为50 μmol·L-1时,酪氨酸酶激活率为183.47%。阳性对照8-MOP的浓度为50 μmol·L-1时,酪氨酸酶激活率为137.62%。总体而言,圣草酚对共培养体系中细胞酪氨酸酶活性的激活作用优于8-MOP。

2.3 圣草酚对共培养体系中细胞黑色素含量的影响(图4)

图4 圣草酚对共培养体系中细胞黑色素合成率的影响Fig.4 Effect of eriodictyol on melanin synthesis rate of cells in co-culture system

由图4可见,与空白对照组比较,12.5～50 μmol·L-1圣草酚能显著提高细胞黑色素合成率(P<0.01或P<0.0001)。在圣草酚浓度为25 μmol·L-1时,黑色素合成率为258.92%,促黑色素合成作用最强(P<0.0001);阳性对照8-MOP的浓度为50 μmol·L-1时,黑色素合成率为204.08%。总体而言,圣草酚对共培养体系中细胞的促黑色素合成作用优于8-MOP。

2.4 圣草酚对共培养体系中TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表达的影响(图5)

图5 圣草酚对共培养体系中TYR(a)、TRP-1(b)、TRP-2(c)基因相对表达量的影响Fig.5 Effect of eriodictyol on relative gene expression level of TYR(a),TRP-1(b),and TRP-2(c) in co-culture system

由图5可见,圣草酚能促进TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表达,其中TYR、TRP-1的基因相对表达量呈剂量依赖性增加。与空白对照组比较,12.5～50 μmol· L-1圣草酚能显著提高共培养体系中TYR的基因相对表达量(P<0.01或P<0.001),25～50 μmol·L-1圣草酚能显著提高TRP-1、TRP-2的基因相对表达量(P<0.01)。

2.5 讨论

黑色素生成减少及黑色素细胞破坏被认为是白癜风发生的主要原因,黑色素在黑色素细胞内合成,传递到邻近的HaCaT细胞,并随HaCaT细胞转移至表皮层,影响皮肤颜色[12-14]。TYR是一种多亚基含铜氧化还原酶,具有独特的双重催化功能,是生物体内黑色素合成的关键酶,TYP活性降低会导致黑色素合成反应十分缓慢。酪氨酸家族基因TRP-1、TRP-2负责色素沉着的转录调控[15]。

驱虫斑鸠菊是治疗白癜风的特色药物[16]。20世纪70年代,驱虫斑鸠菊针剂就被用于治疗白癜风,并证明有促进复色的作用[17-19]。驱虫斑鸠菊植物中治疗白癜风的有效成分主要为黄酮类和咖啡酸类等化合物[20-21],其中黄酮类化合物是研究重点。圣草酚是驱虫斑鸠菊黄酮类化合物。本研究通过考察不同浓度圣草酚作用于HaCaT细胞和B16细胞共培养体系,发现低浓度圣草酚可明显促进共培养体系中细胞增殖、酪氨酸酶活性提升、黑色素合成,并显著提高TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表达量。

HaCaT细胞和B16细胞共培养体系能较好地模拟表皮微环境。本研究发现圣草酚可能通过提高TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表达来促进共培养体系中细胞的酪氨酸酶活性提升和黑色素合成,为开发治疗白癜风的新型药物提供了一定的科学依据。调节TYR、TRP-1、TRP-2的基因表达以及影响HaCaT细胞和B16细胞之间的相互作用,可能是圣草酚治疗白癜风的作用机制之一,但圣草酚促进共培养体系中细胞黑色素合成是通过哪些细胞内信号通路进行调节、HaCaT细胞在白癜风发生发展中如何发挥作用、有哪些外泌体以及相关成分参与、是否能促进黑色素小体的转运、分泌哪些细胞因子等问题尚不明确,需要进一步研究。

3 结论

建立了HaCaT细胞与B16细胞体外共培养体系模拟“表皮黑色素形成单位”,分别用不同浓度圣草酚干预共培养体系,发现圣草酚在低浓度下对共培养体系中的细胞无毒性作用,而且有明显的促增殖作用;12.5～50 μmol·L-1圣草酚对共培养体系中细胞酪氨酸酶活性有激活作用(P<0.001),并呈剂量依赖性;12.5～50 μmol·L-1圣草酚能显著提高共培养体系中细胞黑色素合成率(P<0.01或P<0.0001);12.5～50 μmol·L-1圣草酚能显著提高共培养体系中TYR的基因相对表达量(P<0.01或P<0.001),25～50 μmol·L-1圣草酚能显著提高共培养体系中TRP-1、TRP-2的基因相对表达量(P<0.01)。圣草酚可能通过促进TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表达来促进共培养体系中细胞酪氨酸酶活性提升和黑色素合成。