常见塑料的微生物降解研究进展

陈张燕,郑燕虹,刘湘晴,李海玥,夏 丽,杨坪萍,李 芹,2,刘 峰,2*,张怀东,2*

(1.福建师范大学生命科学学院,福建 福州 350117;2.工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心,福建 福州 350117)

1 塑料污染概况

塑料产品由于生产成本低、耐用性好,广泛应用于各个领域。塑料可以分为热塑性塑料和热固性塑料。目前最常使用的塑料是聚乙烯(polyethylene,PE)、聚丙烯(polypropylene,PP)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚氨酯(polyurethane,PU)、聚苯乙烯(polystyrene,PS),除了PU是热固性塑料外,其余5种均为热塑性塑料。广泛应用于包装材料、薄膜、饮料瓶和玩具的主要是PE、PET、PP和PS;PVC广泛应用于建筑材料、管道和电线电缆;PU则被应用于轮胎和保险杠等;产量较大的依次是PE、PP、PVC。据估计,全世界原始塑料的总产量达到83 亿t,仅有20%左右的废弃塑料被回收利用或者焚烧,其余的都堆积在垃圾填埋场或者自然环境中[1]。塑料垃圾已经被发现出现在地球的多个区域,例如南大洋的海洋沉积物和地表水[2]、北极弗拉姆海峡、瑞士阿尔卑斯山[3]等。

废弃塑料经过焚烧处理,会产生有毒的挥发性废物,如呋喃、二噁英、硫化物等,这些都被认为是潜在的致癌物[4],会对空气造成严重的污染。经过填埋处理的废弃塑料会渗入土壤,毒害土壤物种,改变土壤微生物生态环境[5]。散布在水环境中的废弃塑料对水生生态系统造成巨大的破坏,会缠绕水生动物,摄入后导致肠道堵塞[6],并且在非生物因素或生物因素作用下形成小粒径(<5 mm)的微塑料,导致微塑料污染。微塑料在紫外线照射下会产生各种降解产物,其中气体产物,主要是挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOC)通常被忽视,对人类和环境造成潜在未知风险[7]。环境中的塑料碎片甚至可以分解为纳米(<1 000 nm)塑料,纳米塑料更容易被生物体吸收,对生态和健康的威胁可能比微塑料更大[8]。海洋中的鱼类[9]、虾类[10]、贝壳类[11]均被检测出微塑料的存在。微塑料不仅可以改变土壤结构和微生物群落,还可以通过植物根系进入植物体内[12],开发和完善生物降解塑料的绿色循环工艺对确保未来的食品安全以及减少环境污染具有重大意义。Sanchez-Vidal等[13]发现,海洋海藻Posidonia会将塑料颗粒卡住,Posidonia球形团聚体每年可以捕获多达8.67亿个塑料微粒。Wang等[14]发现,大型蚤暴露在不同粒径的PE微塑料MP-20(20 μm)和MP-30(30 μm)中均导致存活率和心率显著降低。Wang等[15]研究发现,蜜蜂摄入的100 nm的PS会堵在花粉孔上,干扰肠道菌群利用花粉中的营养,导致肠道发育不良和炎症,最终导致蜜蜂体重显著减轻和死亡率提高。

2 塑料的微生物降解

2.1 聚乙烯(PE)

PE是由乙烯聚合而成的最丰富的石油基塑料合成材料,广泛应用于日常生活、工业及农业。2020年全球PE产能为12 690.6 万t,产量为10 630.8万t,产量约占塑料总产量的1/4。PE生产方法按聚合压力的高低可以分为高压法、中压法、低压法,其中低压法可以分为淤浆法、溶液法、气相法。主要的PE产品有:低密度PE(low-density polyethylene,LDPE)、线性低密度PE(linear low-density polyethylene,LLDPE)和高密度PE(high-density polyethylene,HDPE)。PE塑料的回收方式主要有机械回收、化学回收和能量回收。PE的聚合物链非常稳定,化学回收相对困难,主要利用机械回收方式。2021年, Haussler等[16]在分子水平上使用了“断点”的方法回收PE塑料,更加节能,且回收率高达96%。

已报道的降解PE的微生物主要有细菌、真菌和藻类,其中数量最多的是细菌(表1)。

表1 PE降解菌株Tab.1 PE-degrading strains

Balasubramanian等[21]筛选出2株高效降解HDPE菌株Pseudomonassp.GMB7和Arthrobactersp.GMB5,孵育30 d后HDPE样品分别失重15%和12%;Bhatia等[23]筛选出LDPE降解菌株PseudomonascitronellolisEMBS027,4 d降解率达到最高(17.8%);Usha等[24]分离出链霉菌StreptomycesKU8,60 d降解率为22.58%±0.03%;Gilan等[26]分离出1株细菌RhodococcusruberC208,培养30 d后PE薄膜降解率为8%;Yang等[36-37]从印度粉蛾(Plodiainterpunctella)肠道中分离出2株降解PE菌株EnterobacterasburiaeYT1和Bacillussp.YP1,培养60 d后分别能降解6.1%±0.3%和10.7%±0.2%的PE薄膜;Montazer等[46-47]分离出细菌AcinetobacterpittiIRN19,孵育28 d能够将PE薄膜降解26%;Hadad等[50]分离出细菌Brevibaccillusborstelensis,孵育30 d后PE质量和分子量分别降低了11%和30%;Elsamahy等[54]构建了从白蚁肠道中分离的SterigmatomyceshalophilusSSA1575、MeyerozymaguilliermondiiSSA1547和MeyerozymacaribbicaSSA1654组成的酵母菌群,该菌群导致LDPE拉伸强度降低63.4%、净质量减少33.2%。

目前已发现的能降解PE的酶主要是漆酶和烷烃羟化酶。Santo等[27]用细胞外漆酶孵育的类似PE的FTIR分析显示羰基峰增加,表明漆酶在PE的生物降解中起主要作用。烷烃羟化酶系统中最重要的酶是单加氧酶,不同的细菌中烷烃羟化酶的数量和类型差异很大。大多数PE降解酶只能对PE进行末端氧化(聚烯烃中末端碳被氧化)和亚末端氧化(聚烯烃中靠近末端碳被氧化)。例如,漆酶和锰过氧化物酶可以进行末端氧化,AlkB家族可以通过末端或亚末端羟基化反应降解PE的主要成分正烷烃[61]。红球菌TMP2基因组编码5个AHs(alkB1,alkB2,alkB3,alkB4,alkB5),而铜绿假单胞菌基因组编码2个AHs(alkB1、alkB2)[31]。Yoon等[17]研究表明,P.aeruginosaE4的AlkB酶在LMWPE矿化和生物降解转化为CO2过程中发挥核心作用,在菌株E4中克隆到alkB基因,重组菌株表达的AlkB酶参与了低分子量PE生物降解的早期阶段。

Elsamahy等[54]构建了从白蚁肠道中分离的酵母菌群,并提出了假设LDPE生物降解途径,揭示了几种代谢产物的形成过程。该生物降解机制始于烷烃(如十三烷)的形成,再转化为较低分子量的烷烃(如十二烷);十二烷在乙醇和由漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的活性形成的乙基自由基的存在下转化为正十二烷-1-醇,随后转化成正十二烷酸(羧酸)。十四烷酸在酵母细胞中与辅酶A反应产生十四酰辅酶A(其转化为脂肪酸),并参与β-氧化以产生乙酰辅酶A,乙酰辅酶A参与三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)并随后矿化为CO2和H2O。

烷烃羟化酶是细菌有氧降解烷烃的关键酶。第一步是C-C键的羟基化,释放伯醇或仲醇,氧化生成酮或醛,随后生成亲水羧酸[62];由于羧酸的形成,微生物氧化减少了羰基的数量。羧基正链烷烃类似于脂肪酸,由细菌通过β-氧化途径分解(图1)。Usha等[24]和Yoon等[17]已经证明细菌通过 β-氧化途径和三羧酸循环对正烷烃进行微生物氧化。在此过程中通过酶催化降解产生的氧化产物可能被微生物细胞吸收,从而被分解代谢。

图1 PE的生物降解过程Fig.1 Biodegradation process of PE

2.2 聚丙烯(PP)

PP是一种半结晶热塑性塑料。PP按单体种类可以分为:均聚PP(polypropylene homopolymer,PP-H)、无规共聚PP(polypropylene random,PP-R)和嵌段共聚PP(polypropylene block copolymer,PP-B)。2019年,Plastics Europe报道PP塑料的需求占塑料总需求的19.3%。2020年,PP全球产量为7 539.5万t。PP的传统生产方法主要有溶液法、淤浆法、本体法、气相法和本体-气相法,随着生产工艺的不断改进,淤浆法逐渐被淘汰。目前,PP的先进生产工艺有Spheripol工艺、Spherizone工艺和Borstar工艺[63]。PP塑料的回收方式主要有材料资源化、化学回收和能量回收。材料资源化回收主要对废弃PP进行简单再生利用和改性再生利用;化学回收主要采用热分解法;由于能量回收采用焚烧技术会产生大量有害气体、工艺流程长且费用高,故大受限制。

目前,已发现的PP降解菌株数量较少(表2)。

表2 PP降解菌株Tab.2 PP-degrading strains

Auta等[66]分离出2株细菌Bacillussp.和Rhodococcussp.,孵育40 d后PP样品失重率分别为4.0%和6.4%;Skariyachan等[67]分离出8株塑料降解菌,其中,AneurinibacillusaneurinilyticusbtDSCE01、BrevibacillusagribtDSCE02、Brevibacillussp.btDSCE03和BrevibacillusbrevisbtDSCE04混合菌群的降解率最高且高于单一菌株,50 ℃下培养140d后PP降解率高达56.3%±2.0%;Jeon等[68]筛选出细菌StenotrophomonaspanacihumiPA3-2,堆肥90 d后对LMWPP-1(Mn2 800,Mw10 300)的降解率为20.30%±1.39%,对LMWPP-2(Mn3 600,Mw17 900)的降解率为16.60%±1.70%。

2.3 聚氯乙烯(PVC)

PVC是由引发剂作用于氯乙烯单体聚合而成的一种热塑性塑料。2020年,全球PVC产量为5 431万t。PVC的工业化生产工艺一般有4种:悬浮聚合、本体聚合、乳液聚合和溶液聚合[69]。根据聚合方法的不同可以将PVC分为:悬浮法PVC、乳液法PVC、本体法PVC和溶液法PVC。PVC塑料的回收方式主要有机械回收、化学回收和能量回收。由于化学回收的工艺复杂,成本较高;能量回收会产生有害气体,PVC的回收方式主要采用机械回收。

目前,关于PVC聚合物及塑料的生物降解的报道较少,多数利用真菌进行PVC塑料降解(表3)。

表3 PVC降解菌株Tab.3 PVC-degrading strains

Das等[71]筛选出2株细菌PseudomonasaeruginosaNBTU01和Achromobactersp.NBTU02,180 d后对PVC的降解率分别为35.65%和34.63%;Webb等[74]分离的真菌Aureobasidiumpullulans使PVC薄膜质量损失3.7%±0.7%;Ali等[75]筛选出4株PVC降解真菌,其中PhanerochaetechrysosporiumPV1的降解性能最高;Giacomucci等[77]分离出2株细菌Pseudomonascitronellolis和Bacillusflexus,其中,Pseudomonascitronellolis在培养30 d后就能部分降解PVC薄膜。

目前尚未发现直接参与PVC降解的酶的相关报道。Sumathi等[76]分离出1株产漆酶的PVC降解菌株Cochliobolussp.,以低密度PVC为唯一碳源,经菌株处理的PVC与未经处理的PVC存在明显差异,推测漆酶是Cochliobolussp.降解PVC的关键酶。

2.4 聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)

PET是由对苯二甲酸与乙二醇缩聚而成的热塑性塑料,分纤维和非纤维两大类。PET的生产工艺主要有3种:酯交换法、直接酯化法和环氧乙烷法。工业上PET塑料的回收方式主要是机械回收和化学回收,机械回收相对成熟,化学回收成本较高,因此,PET的回收方式主要采用机械回收。

目前,关于PET微生物降解的报道较少,已发现的降解PET的微生物主要有Ideonellasakaiensis[78]、Micbacteriumoleivorans[79]、Comamonastestosteroni[80]、Thermobifidasp.[81-83]、Fusariumsp.[84-85]和Streptomycessp.[86](表4)。

表4 PET降解菌株Tab.4 PET-degrading strains

已研究的能降解PET的酶主要为酯酶、角质酶和脂肪酶。Kleeberg等[88]从Thermobifidafusca中纯化出脂肪酶BTA-1,该酶可以在3周内将商业PET饮料瓶和PET颗粒水解40%～50%,这是较早的对PET降解酶的报道。

Sulaiman等[89]从枝叶堆肥的微生物基因组克隆了LCC角质酶编码基因,利用大肠杆菌对LCC进行表达,经鉴定,LCC具有降解聚己内酯和PET的能力,且酶活较高,LCC为PET降解酶的分子机理提供了很好的模型,并且具有较高的应用价值。Tournier等[90]通过饱和突变和定向进化构建了LCC的突变体ICCG,其催化温度和降解效率都得到较大的提升。

Yoshida等[78]鉴定了Ideonellasakaiensis201-F6中2个起关键作用的酶PETase和MHETase。Joo等[91]解析了PETase的分子结构,通过蛋白质工程构建了具有增强蛋白质活性的IsPETase突变酶,并通过实验证明:201-F6可以附着在PET塑料表面,利用胞外酶PETase将PET降解成单(2-羟乙基)对苯二甲酸(monohydroxyethyl terephthalate,MHET), 同时产生微量的双(2-羟乙基)对苯二甲酸[bis(2-hydroxyethyl) terephthalate,BHET],MHET可以进入细胞,被MHETase进一步降解成乙二醇(ethylene glycol,EG)和对苯二甲酸(terephthalate,TPA),如图2所示。

图2 PET的生物降解过程Fig.2 Biodegradation process of PET

Cui等[92]将PETase突变为更嗜热的DuraPETase,该突变酶在60 ℃高温下孵育3 d仍能保持活性,对PET薄膜的降解率达到23%。Lu等[93]使用机器学习系统预测PETase的突变,通过对突变体进行工程改造,确定了一种命名FAST-PETase的突变酶;FAST-PETase可以在1周内几乎完全降解PET废旧塑料。该课题组展示了一个闭环PET回收过程,首先使用FAST-PETase快速降解PET废旧塑料,然后回收单体并重新聚合成原始PET,该过程可在短短几天内完成。

2.5 聚氨酯(PU)

PU是一种主链含有氨基甲酸酯基的大分子化合物。PU主要分为两大类:以二异氰酸酯和端羟基聚酯为原料制备的聚酯型PU、以二异氰酸酯和端羟基聚醚为原料制备的聚醚型PU。PU塑料的回收方式主要有机械回收、化学回收和能量回收。机械回收主要有粘结成型、用作填料和热压成型;化学回收主要有醇解法、水解法和碱解法[94]。Liu等[95]研究了亚/超临界甲醇降解PU废旧塑料的过程,发现,在230 ℃、7.2 MPa、50 min条件下,PU废旧塑料的降解率超过 90%,降解液主要成分含有 4,4′-二苯基甲烷氨基甲酸酯、聚酯二醇和1,4-丁二醇。

目前已报道的PU降解微生物中,真菌的数量较多,主要来源于土壤(表5)。

表5 PU降解菌株Tab.5 PU-degrading strains

Peng等[98]筛选出3株细菌,其中PseudomonasputidaA12的降解活性最高,4 d内可以降解92%的水性PU(Impranil);Nakajima-Kambe等[99]筛选出2株聚酯型PU降解菌,其中,ComamonasacidovoransTB-35培养7 d后对PU的降解率为48%;Crabbe等[103]从华盛顿特区花园土壤中分离出4株真菌,分别为Curvulariasenegalensis、Fusariumsolani、Aureobasidiumpullulans和Cladosporiumsp.,其中Curvulariasenegalensis的降解活性最高;Khan等[106]分离出真菌Aspergillustubingensis,可以在自然环境中使难降解塑料在2周内出现明显的生物降解迹象,在液体培养基中使PU薄膜在2个月内完全降解;Russell等[111]分离得到1株植物内生真菌Pestalotiopsismicrospora,2周内对PU的降解率达到99%。

目前,对PU降解微生物中相关酶的分离纯化已有不少报道,但其降解机理是通过测定酶学性质和降解产物推测得到的,还未获得PU降解的完整历程。Peng等[98]通过酶学分析检测到PseudomonasputidaA12能分泌酯酶,该酶具有PU降解活性,分子量45 kDa;Akutsu等[100]对ComamonasacidovoransTB-35进行研究,发现菌株TB-35能分泌1种新型的塑料降解酯酶,可以水解PU的酯键;Crabbe等[103]通过二乙酸荧光素水解测试发现Curvulariasenegalensis可分泌胞外酯酶;Russell等[111]发现Pestalotiopsismicrospora分泌的丝氨酸水解酶对降解PU起关键作用。

2.6 聚苯乙烯(PS)

PS是由苯乙烯聚合而成的热塑性塑料。PS的聚合方式有本体聚合、溶液聚合、悬浮聚合及乳液聚合,工业上主要采用本体聚合和悬浮聚合。PS主要分为:普通PS(general purpose polystyrene,GPPS)、可发性PS(expandable polystyrene,EPS)、高抗冲PS(high impact polystyrene,HIPS)和间规PS(syndiotacticpolystyrene,SPS)。PS塑料的回收方式主要有材料资源化和化学回收。材料资源化一般采用直接回收和改性回收两种方式。Ward等[113]研究了一种新的PS回收方式,即将PS热解为苯乙烯油,然后通过假单胞菌Aca-3(NCIMB 41162)将苯乙烯油转化为聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)。

目前,已发现的降解PS的微生物主要是细菌,其中数量较多的是假单胞菌和芽孢杆菌(表6)。

表6 PS降解菌株Tab.6 PS-degrading strains

O′Connor等[115]分离出可以利用苯乙烯作为唯一碳源的细菌PseudomonasputidaCA-3;Kim等[118]从大麦虫肠道中分离得到1株PS降解细菌PseudomonasaeruginosaDSM50071;Ganesh-Kumar等[120]筛选出1株细菌BacillusparalicheniformisG1,培养60 d后可降解34%的PS薄膜;Yang等[126]发现黄粉虫幼虫在16 d内可将摄入的47.7%的PS塑料碳转化为CO2。

O′Connor等[115]对菌株PseudomonasputidaCA-3诱导和抑制苯乙烯降解的分子机制进行研究,证明了谷氨酸和柠檬酸盐均能抑制苯乙烯降解;Ganesh-Kumar等[120]研究发现,编码单加氧酶、双加氧酶、过氧化物酶、酯酶和水解酶的基因参与了PS薄膜的降解;Yang等[126]发现,在PS降解过程中,菌株PseudomonasaeruginosaDSM50071中丝氨酸水解酶(serine hydrolase,SH)的基因表达水平高度上调,通过SH抑制剂处理实验进一步证实了PS的酶介导生物降解。

3 结语

塑料由于其稳定的化学结构、较高的分子量、极强的疏水性和结晶度,在自然界中很难被降解,主链中具有可水解酯键的PET、PU较具有碳链骨架的PE、PP、PS、PVC更容易被生物降解。已报道的具有塑料降解能力的微生物主要是PE和PU降解菌,其它塑料降解菌的报道较少,细菌主要有假单胞菌属和芽孢杆菌属,真菌主要有曲霉菌属和地霉菌属;有关PE和PET降解酶的研究报道相对较多,还未发现与PP和PVC降解相关的酶。大多数PE降解酶只能对PE进行末端氧化和亚末端氧化。PET生物降解近年来在微生物和酶机制方面取得了显著进展,更接近工业化实施,处于更高的技术水平[127]。Tournier等[90]通过饱和突变和定向进化构建了LCC的突变体ICCG,以此为基础,建立了PET循环工艺,为PET的工业化循环利用提供了很好的范例。

目前除了PE和PET,其它塑料的生物降解的完整途径和机制尚不清楚。在PE降解过程中C-C键在烷烃羟化酶的作用下羟基化,释放伯醇或仲醇,氧化生成酮或醛,随后生成亲水羧酸[17]。PET降解酶PETase可以将PET降解成单(2-羟乙基)对苯二甲酸(MHET),同时产生微量的双(2-羟乙基)对苯二甲酸(BHET),MHET可以进入细胞,被MHETase进一步降解成乙二醇(EG)和对苯二甲酸(TPA)[91]。

真实环境条件复杂多变,生物降解可能会与其它环境行为同时发生、相互影响。有关降解菌和降解酶的研究仍停留在实验室阶段,模拟工业化应用对于深入研究回收工艺及实际应用具有重要意义。虽然生物降解是一种绿色环保的塑料废弃物处理方式,但效率仍然较低。目前发现的能高效降解塑料的酶很少,大部分塑料的降解机制及完整途径尚未发现。利用现代微生物育种技术提高降解菌的降解效率,依托基因组学深入挖掘降解基因及降解酶,通过合理的蛋白质工程和定向进化的方法提高降解酶的活性和稳定性,这些措施都可以在提高效率的同时使其更适应于工业生产需要。此外,塑料的大分子聚集体结构阻碍了酶的降解效率,物理或化学预处理有助于破坏这些大分子结构以提高酶的降解效率。将温和的微生物法或酶法降解与物理或化学处理工艺相结合开发可持续的塑料降解和循环利用工艺具有广阔的应用前景。