包头地区295例VVC分离株的菌种分布及药物敏感性分析*

王 娜,张利霞,胡同平,王占黎,石继海,郭丽娜,易星驰,李宏雨

(1.内蒙古科技大学包头医学院2020级研究生,内蒙古包头 014040;2.包头医学院第一附属医院;3.包头医学院第二附属医院)

外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是由念珠菌感染所致的阴道炎,也称霉菌性阴道炎。70%～75%的女性在其一生中至少会感染1次,其中50%的人会经历复发,有研究表明,15至50岁的女性中有8%感染并复发。每年复发≥3次称为复发性外阴阴道念珠菌病(RVVC)[1]。在大多数研究中,与其他念珠菌[2-3]相比,白念珠菌被报道为这种感染最常见的原因。本研究对2021年包头地区295例VVC患者标本分离的念珠菌培养、鉴定及药敏情况进行统计分析,现报告如下。

1 资料与方法

1.1标本来源 收集2021年1月至2021年12月在包头地区某三甲医院妇科及产科门诊就诊的女性患者阴道分泌物分离到的295株念珠菌进行了研究。所有患者均依据临床症状和阴道分泌物直接镜检及培养阳性诊断为VVC。本研究通过伦理委员会审查,患者知情同意。

1.2标本采集及镜检 由专业的妇科医生借助扩阴器,用专用一次性无菌拭子于患者阴道后穹窿处采集阴道分泌物,置于无菌培养试管,立即送检。将阴道分泌物加少量生理盐水制备成湿片,采用革兰氏染色方法,通过光学显微镜观察,若观察到卵圆形芽生孢子或假菌丝则视为镜检阳性。

1.3分离培养及鉴定 采集的阴道分泌物及时接种于沙保罗平板上,置于35 ℃恒温培养箱中培养24～48 h,观察培养结果并进行保存。白念珠菌的鉴定多采用MALDI-TOF MS,难以鉴定的菌株采用分子生物学方法进行菌种鉴定。PCR扩增使用的引物选用ITS1和ITS4,序列为ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。扩增产物的测序由上海生工完成,结果上传至Genebank进行BLAST碱基比对后分析确定菌株的种别。

1.4药敏试验及判断 采用微量肉汤稀释法对所有菌株进行9种抗真菌药物体外敏感性试验,药敏试验检测的抗真菌药物包括氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B、特比奈芬、制菌霉素、5-氟胞嘧啶和卡泊芬净。所有药物均来自Sigma公司,C.parapsilosis ATCC 22019和C. krusei ATCC 6258作为质控菌株判读参考CLSI M60[4]。所有分离株于沙保罗传代后置于35 ℃培养箱培养24～48 h,确保其活力和纯度。菌落悬浮于无菌生理盐水中,通过血球计数板在高倍显微镜进行计数,用RPMI 1640培养基将菌悬液的最终浓度调整为1×103～5×103CFU/mL。加入菌液和药液各100 μL于96孔板中35 ℃下孵育24 h或48 h,根据CLSI参考指南M27-S4[5]、M59[6]和流行病学界值进行结果判读,测定最低抑菌浓度(MIC)。

1.5统计学分析 对患者年龄、菌种分布及药敏情况进行统计分析,数据分析用SPSS软件处理,计数资料采用率(%)表示,比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1VVC患者年龄分布情况 295例患者13～84岁、平均年龄32.8岁,以31～35岁的年龄段患者百分比最高(30.85%),其次是26～30岁年龄段(20.34%)和21～25岁年龄段(16.27%),在这些患者中,21～40岁年龄段比例达到82.04%,231例(78.31%)有正常的性生活,36例正处于妊娠状态,21例长期口服避孕药,9例有基础疾病糖尿病,6例有雌激素用药史,见表1。

表1 阴道念珠菌感染患者年龄及易感因素分布(n=295)

2.2分子生物学方法鉴定少见菌种 部分MALDI-TOF MS鉴定结果见图1,PCR扩增产物测序结果见图2,其中MALDI-TOF MS鉴定中得分>2分,ITS区扩增产物测序结果上传至Genebank进行BLAST碱基比对同源性达到99%,为可接受的结果。

图1 菌株14号MALDI-TOF MS结果图

图2 菌株14号ITS区基因测序图与BLAST比对图

2.3VVC致病菌菌种分布 2021年1月至12月共收集到295份确诊为VVC患者的标本,经分离培养鉴定其中白念珠菌分离率居首位,非白念珠菌中以光滑念珠菌和克柔念珠菌为主,见表2。

表2 VVC菌种分布情况

2.4药敏情况

2.4.1白念珠菌的药敏情况 白念珠菌对氟康唑和伏立康唑的敏感性分别为71.4%和72.2%,对泊沙康唑、两性霉素B、卡泊芬净和5-氟胞嘧啶的敏感性最高(表3),因制霉菌素和特比奈芬暂无判读折点只列出具体MIC值分布。制霉菌素的MIC值均集中在0.031 3-0.125 μg/mL之间(不再列出其他值),但特比奈芬的MIC值有119株为>64 μg/mL,占比达到50.9%(119/234),且MIC值≥2 μg/mL占比达到92.3%(216/234),耐药率最高(表4)。

表3 白念珠菌药物敏感性判读结果(μg/mL)

表4 白念珠菌和非白念珠菌对特比奈芬和制霉菌素的具体MIC值数量分布

2.4.2非白念珠菌药敏情况 非白念珠菌中光滑念珠菌对氟康唑的敏感性高达97.6%,只有1株为SDD,反而卡泊芬净的敏感性不如氟康唑。克柔念珠菌中出现1株伏立康唑耐药株和1株卡泊芬净耐药株(表5),同样经统计两者对特比奈芬的耐药率最高。少见念珠菌的具体MIC值见表6。

表5 非白念珠菌药物敏感性判读结果(μg/mL)

表6 少见念珠菌对9种药物的MIC值(μg/mL)

2.5白念珠菌与非白念珠菌的比较 白念珠菌与非白念珠菌对抗真菌药物的耐药性相差较大,χ2检验比较分析发现,白念珠菌对伊曲康唑的耐药率高于非白念珠菌(P<0.01),而非白念珠菌对卡泊芬净和5-氟胞嘧啶的耐药率要比白念珠菌高(P<0.01),见表7。

表7 白念珠菌与非白念珠菌耐药性比较

3 讨论

研究表明,阴道内乳酸杆菌缺失或菌种比例失调(产过氧化氢的卷曲乳杆菌减少,几乎不产过氧化氢的惰性乳杆菌增加)、阴道局部内分泌功能的改变(妊娠、口服避孕药、糖尿病等)及宿主阴道解剖结构和黏膜免疫功能异常是念珠菌过度繁殖、影响VVC发生发展的4个重要方面[7]。本研究标本来源于包头地区几所综合型三甲医院,病例诊断通过查询各院信息系统获得,培养鉴定及药敏结果在包头医学院第一附属医院的微生物室完成,该室是全国真菌耐药监测网的成员单位,质量控制体系完善,且每年全国室间质评成绩优秀,为本实验提供了技术支撑。资料显示,295例患者中,21～40岁是VVC的高发年龄,糖尿病、妊娠、避孕药的使用是排在前三位的易感因素,这些诱因改变了阴道微环境,打破了微生态平衡,使念珠菌成为致病菌。

目前发现可引起VVC的念珠菌菌种已达15种以上[8]。VVC的病原谱流行病学数据表明,在不同国家和同一国家的不同地区存在差异,美国、欧洲和西班牙的研究显示白念珠菌占70%～89%,光滑念珠菌占3.4%～20%[9]。在亚非地区(尼日利亚、布基纳法索、伊朗、印度等)白念珠菌的比例较低,非白念珠菌的比例较高,尤其是光滑念珠菌比例高达30%～50%[10]。我国的多数研究结果显示,引起VVC的病原菌以白念珠菌为主,且占比与美国某些地区报道相近[11-12]。本研究主要通过MALDI-TOF MS的方法鉴定,对于该法提示的“无鉴定结果”或鉴定结果不可靠的分离株,则使用核糖体转录区间PCR及DNA序列测定比对法进行鉴定。结果表明,本地区VVC常见的病原菌为白念珠菌(占比79.32%),其次是光滑念珠菌(占比13.90%)、克柔念珠菌(占比4.41%),另外尼瓦利亚念珠菌、挪威念珠菌、布加拉念珠菌等少见菌株各1株。中国真菌耐药监测网(CHIF-NET)数据表明,非白念珠菌引起的侵袭性感染逐年增加,其中光滑念珠菌复合体是主要占比之一,而复合体中的尼瓦利亚念珠菌的分离株报道逐渐增多[11]。少见念珠菌存在多重耐药、致病力强和鉴定困难等特点,少见念珠菌已开始在部分地区迅速流行,这也必将影响阴道念珠菌病原谱的改变。由于不同念珠菌物种具有不同的侵袭性、致病力与耐药性,因此明确感染部位的念珠菌菌种分布十分必要。

唑类药物具有价格便宜、毒性低、使用方便的优点,常作为治疗念珠菌感染的首选药物。既往多数文献表明氟康唑对来自VVC的白念珠菌分离株具有较高的活性[12-13]。如在美国、巴西、阿根廷、土耳其、意大利的多项研究表明,氟康唑对VVC中白念珠菌分离株的敏感性为90%～100%[14-15]。但在中国,除来自深圳某研究数据(98.1% S和88.3% S)[16]与西方国家有相似的敏感性报告以外,大多数报告显示敏感率较低[17]。我们的研究报告显示,白念珠菌对氟康唑的敏感性(71.4%)低于西方报道,与国内报道基本相一致,且SDD占比也较多,可能与该地区临床用药习惯或患者自行用药有关。

本研究中白念珠菌对唑类中的伊曲康唑耐药率达38.9%,远高于其他唑类药物。这与Ghaddar等[18]在黎巴嫩(西南亚国家)的研究结果相差较大,可能与我们临床的用药习惯不同有关,虽没有我国学者王凤捐等[19-20]报道的51.5%高,但仍值得关注。致伊曲康唑较低活性这一情况可能与我国临床使用频率相对较高有关,所以我国在面对这种情况更需临床医生注意,更要关注耐药情况。我们的结果还表明,20株氟康唑耐药菌株中有4株对伏立康唑耐药,有17株为中介。此外,对氟康唑敏感性降低的分离株对伊曲康唑和伏立康唑表现为交叉耐药,18株对氟康唑和伊曲康唑均耐药,4株对氟康唑和伏立康唑均耐药。此外,有4株对氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑均耐药。念珠菌监测研究表明,对氟康唑的耐药性是对伏立康唑耐药性的高度预测[21],本研究中的多数氟康唑耐药株同时对伏立康唑的敏感性降低或出现耐药现象,与念珠菌监测中的高度预测较一致,提示在临床用药中如氟康唑出现耐药情况,尽量不考虑使用伏立康唑和伊曲康唑。上述研究中对氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的耐药性的增加可归因于散发性VVC的频繁经验性治疗和病人私自给药,这可能导致耐药性白念珠菌引起VVC感染复发的现象。

许多研究已证明,新三唑(泊沙康唑、伊沙康唑和拉夫康唑)对白念珠菌分离株导致的侵袭性感染有良好体外活性[22],同样我们的研究中白念珠菌对泊沙康唑的敏感性高达95%以上,同时证实了两性霉素B和5-氟胞嘧啶对VVC中白念珠菌分离株的良好体外活性(对5-氟胞嘧啶达95%以上,对两性霉素B的敏感性达到100%)。5-氟胞嘧啶耐药的分离株对其他8种抗真菌药物没有交叉耐药性,这与雷岩等[12]的研究一致。虽目前制霉菌素和特比奈芬暂无判读折点,根据本研究中得到两药的具体MIC值分布可看出,本地区白念珠菌对制霉菌素表现出良好的药物活性,但对特比奈芬而言,其MIC值多数为>64 μg/mL,提示此药物可能无效。棘白菌素因其毒性低,且与唑类药物无交叉耐药,已被广泛应用于侵袭性念珠菌病[23]。Boikov等[17]从VVC分离的60株白念珠菌对卡泊芬净表现出良好的活性,Sharifynia等[24]也报道了从伊朗RVVC患者中分离出的26株白念珠菌对卡泊芬净具有良好的活性。我们的研究中,阴道白念珠菌分离株中对卡泊芬净的敏感率大于95%,这与分离自身体其他部位的白念珠菌药敏报道一致[25]。

此外需要指出的是,非白念珠菌对氟康唑有固有的耐药性,对抗真菌药物的耐药性增加可能会产生重大后果,导致VVC妇女患者的不良结果和更多的慢性感染。Yassin等[26]证实了类似的结果,报道了光滑念珠菌对最常用的抗真菌药物如氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素和特比萘芬表现出耐药性,本研究中(表4)光滑念珠菌只有1株氟康唑耐药株、2株伏立康唑耐药株、1株泊沙康唑耐药株和2株卡泊芬净耐药株。相比较光滑念珠菌,克柔念珠菌除有1株伏立康唑和卡泊芬净耐药株外表现出不一样的耐药现象,全部为5-氟胞嘧啶耐药。但两者对特比奈芬均为高耐药性,提示在临床治疗中特比奈芬的无效。少见念珠菌的耐药情况现如今越来越得到重视,真菌耐药监测网(CHIF-NET)数据显示其有较高的MIC值且易出现耐药现象[11]。本研究中7株少见菌株大多对特比奈芬耐药和平常念珠菌对氟康唑有相对较大的MIC值外,其余均为敏感。但本次实验中少见念珠菌数量少,不足以说明情况,然而鉴于报道的VVC数据而言,不可忽视其少见念珠菌耐药所带来的后果。所以随着抗真菌药物在临床实践中的广泛应用,需要重视外阴阴道念珠菌属的抗真菌敏感性。

综上所述,包头地区VVC病原菌菌种虽仍以白念珠菌为主,但氟康唑的经验性治疗已受到挑战,尤其是复发性VVC。鉴于不同念珠菌对抗真菌药物的敏感性具有差异,临床应及时进行病原学送检,根据感染念珠菌特点,参照药敏结果合理用药,为临床医生成功治疗VVC的方法选择提供指导,以提高疗效减少耐药菌株的产生。