辣椒离体培养及再生体系的建立

李浩宇，贾利，宋婷婷，汪胜，张于，方凌，张其安，严从生，隋益虎，江海坤*

〔1 安徽科技学院，安徽凤阳 233100；2 安徽省农业科学院园艺研究所，园艺作物种质创制及生理生态安徽省重点实验室，农业农村部园艺作物种质创制与利用重点实验室（部省共建），安徽合肥 230031〕

辣椒（CapsicumannuumL.）为茄科一年生或有限多年生草本植物，原产于中南美洲热带地区，在亚洲、欧洲等地广泛栽培。辣椒含有丰富的VC、β-胡萝卜素、叶酸等成分，含有的辣椒素还具有抗炎抗氧化作用，深受广大消费者喜爱（朱丽等，2023）。

目前，辣椒组织培养已经通过子叶（杨博智等，2022）、上胚轴（钟源源 等，2019）、下胚轴（Won et al.，2021）、带柄子叶（徐建中 等，2015）、 茎尖、 花药（ 张天翔 等，2020）、Flamingo-bill（高玉尧 等，2014）等组织获得再生植株。Kim 和Lim（2019）从辣椒CM334 和甜椒Dempsey 的子叶上成功诱导出白色和淡黄色的愈伤组织，并且能够增殖，建立了叶源性愈伤组织形成的条件，最终应用基因组编辑工具来提高辣椒的品质。Oğuz 等（2021）第一次报道了使用根外节为外植体，在3 种茄科作物（辣椒、番茄、茄子）上比较了3 种细胞分裂素〔BAP、TDZ（苯基噻二唑基脲）、GA3（赤霉素）〕对芽再生能力的影响。Won 等（2021）选取辣椒幼苗第一片叶、子叶和下胚轴3 种外植体，用含8 mol · L-16-BA（6-苄基腺嘌呤）和6 mol · L-1IAA（吲哚乙酸）的不定芽诱导培养基（SIM）诱导外植体产生芽，诱导率分别为69.8%、25.5%和19.5%。

目前在国内外辣椒组织培养成功的报道中，普遍存在不定芽伸长困难、分化率低、培养周期长等问题，限制了辣椒基因工程的发展。本试验采用子叶、Flamingo-bill 和下胚轴为外植体，对影响辣椒离体再生的多个因素进行探讨，旨在建立辣椒高效离体再生体系，为进一步开展辣椒遗传转化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试5 种基因型不同的辣椒材料均由安徽省农业科学院园艺研究所提供，代号分别为绿皮羊角椒9931、绿皮灯笼椒WJ-10、绿皮朝天椒22-33、紫皮灯笼椒H18 和紫皮朝天椒M13。试验于2022 年在安徽省农业科学院园艺研究所进行。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的获得 选取颗粒饱满、色泽鲜艳的种子，先用温水浸泡6～8 h，75%酒精消毒1 min，无菌水清洗3 次，再用2.5% NaClO 消毒30 min，无菌水清洗8～10 次后，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于MS 固体培养基（4.74 g · L-1MS 粉 + 30 g · L-1蔗糖 + 8 g · L-1琼脂）中。温度27～28 ℃，暗培养至种子露白，再置于光照下培养，光照强度1 600～1 800 lx，温度24～26 ℃，培养无菌苗。

1.2.2 不定芽的诱导和分化 选取不同苗龄的无菌苗，制备Flamingo-bill 外植体：将无菌苗的一侧子叶从叶柄基部连同顶芽及周围分生组织全部切去，留下另一侧子叶与下胚轴、胚根作为一个外植体。Flamingo-bill 切下来的一片子叶用于制备子叶外植体（0.5 cm × 0.5 cm），将Flamingo-bill 外植体、子叶外植体和下胚轴（切去胚根和上部，切成1 cm的小段）接种于MS 添加不同激素（6-BA 为1、3、5、6 mol · L-1，IAA 为0.3、0.5、1.0 mol · L-1）配比的诱导培养基上。每个处理30 个外植体，3次重复，每2 周继代1 次，培养条件同1.2.1，30 d后统计不定芽分化率。

不定芽分化率 = （分化外植体数/接种外植体数）× 100%

1.2.3 不定芽伸长 将分化出不定芽的外植体接种至MS 添加不同激素（6-BA 为1、2、3 mol · L-1，IAA 为2 mol · L-1，GA3为0、0.5、1.0、1.5 mol · L-1）配比的伸长培养基上，每2 周继代1 次，培养条件同1.2.1，30 d 后统计伸长率。

伸长率 = （伸长不定芽数/接种发生分化外植体数）× 100%

1.2.4 不定芽生根 将伸长的不定芽从母体基部切除，接种于MS 添加不同浓度NAA（0、0.1、0.3、0.5 mol · L-1）的生根培养基上，20 d 后观察不定芽生根情况，统计生根率。

生根率 = （生根不定芽数/接种不定芽数）× 100%

当再生苗长至10～15 cm 时即可炼苗移栽。先在组培室内开瓶炼苗2 d，再放至室外炼苗2 d，之后冲洗干净根部的培养基，移栽至营养土中，待缓苗过后移栽至温室管理直至开花结果。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 软件统计和处理数据。

2 结果与分析

2.1 苗龄对辣椒不定芽分化的影响

不同基因型不同苗龄的Flamingo-bill 外植体的不定芽分化有着较大差异。由图1 可知，随着苗龄的增加，不定芽分化率呈现先升高后降低的趋势，苗龄10 d 时，Flamingo-bill 外植体分化率最高，达81.4%～91.1%；苗龄14 d 时，不定芽分化率最低为61.5%，最高为69.4%；苗龄大于14 d，不定芽分化率大幅下降；苗龄16 d 时，不定芽分化率最低仅为48.8%，且多数只形成愈伤组织。由此得出，制备Flamingo-bill 外植体最适苗龄为10 d。

图1 苗龄对辣椒不定芽分化的影响

2.2 不同外植体和激素配比对辣椒不定芽分化率的影响

将5 种基因型辣椒的Flamingo-bill 和子叶外植体接种到添加不同浓度6-BA 和IAA 组合的MS 分化培养基上（表1），培养1 周左右，在其切口处开始形成愈伤组织，2 周左右开始形成白色松软（图2-a）、绿色紧实（图2-b）或紫色紧实（图2-c）的愈伤组织，4 周左右分化形成不定芽。

图2 子叶再生过程中不同愈伤组织

从表1 还可以看出，在6-BA 浓度为1～6 mol ·L-1、IAA 为0.3～1.0 mol · L-1范围内，5 种基因型辣椒外植体的不定芽分化率均随着激素浓度的升高而升高，其中以绿皮羊角椒9931 在6-BA、IAA 浓度分别为6.0 mol · L-1和1.0 mol · L-1时最高（图3、4），Flamingo-bill 和子叶的不定芽分化率分别达到100.0%和86.7%。

图3 9931 的Flamingo-bill 离体再生情况

图4 9931 的子叶离体再生情况

同时，不同基因型辣椒不定芽分化率也有较大差异，绿皮辣椒9931、WJ-10、22-33 的Flamingobill 和子叶不定芽分化率最高分别为100.0%、90.0%、96.7% 和86.7%、73.3%、80.0%，紫皮辣椒H18 和M13 Flamingo-bill 不定芽分化率最高均为100.0%，但子叶外植体均没有不定芽分化，只形成紫色紧实的愈伤组织（图2），后续采用ZT（玉米素）和IAA 激素组合也没有诱导出不定芽。5 种基因型的辣椒下胚轴均没有诱导出不定芽，且下胚轴容易诱导形成不定根。试验过程中发现子叶和下胚轴外植体容易发生褐化，但Flamingo-bill 外植体未出现该现象。在培养基中添加了5.0 mol · L-1的AgNO3后，褐化现象得到明显改善。综合试验结果，选用9931 进行下一步不定芽伸长和生根工作。

2.3 不同激素配比对辣椒不定芽伸长的影响

由子叶外植体诱导分化出的不定芽呈丛生状，多数为叶状体，不定芽较难分辨，因此将丛生芽连同愈伤组织一同移至伸长培养基诱导伸长。结果表明（表2），Flamingo-bill 外植体不定芽伸长率随着GA3浓度升高不断增加，在不添加GA3的条件下仍达到22.2%。将子叶产生的不定芽转至较低浓度6-BA 的培养基上，伸长率为仅4.4%；在添加GA3的培养基上，配合6-BA和IAA能有效伸长不定芽，GA3浓度为1.5 mol · L-1时，与3.0 mol · L-1的6-BA和2.0 mol · L-1的IAA 配合使用，不定芽伸长效果最好，子叶和Flamingo-bill 不定芽伸长率分别达到30.0%和66.7%。由此得出辣椒9931 不定芽最优伸长培养基配方为：MS + 3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol ·L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3+ 5.0 mol · L-1AgNO3。

表2 不同激素配比对辣椒不定芽伸长的影响

2.4 不同NAA 浓度对辣椒不定芽生根的影响

试验过程中发现9931 的Flamingo-bill 外植体生根较容易，在不添加任何激素的MS 培养基上，20 d 就可生根，生根率为100.0%。由子叶外植体形成的不定芽，在低浓度NAA 培养基下，根系生长缓慢，不定根瘦弱短细，多数为鸡爪根（图5-a、b），且移栽较难成活，NAA 浓度为0.3～0.5 mol · L-1时，不定根生长正常，主根粗壮，须根较多（图5-c、d），移栽成活率为100.0%（表3）。由此得出最适子叶生根培养基配方为：MS + 0.5 mol · L-1NAA。

表3 不同浓度NAA 对辣椒不定芽生根的影响

图5 添加不同浓度NAA 对不定芽生根的影响

3 讨论

3.1 苗龄对辣椒不定芽分化的影响

在外植体制备时，不同苗龄阶段所获取的外植体具有不同的分化能力。以子叶为外植体时，生长周期过短，两片子叶尚未平展，切取时不易操作；培养周期过长，植株生长消耗大量养分，同时会降低不定芽的分化能力。以Flamingo-bill 为外植体时，生长周期过短，茎尖生长点还未发育完全，制备时无法完全切除，从而导致后期遗传转化时出现假阳性植株；培养周期过长，植株生长消耗大量养分，长势太快，不易操作且不定芽分化率也大大降低。试验过程中发现，不同基因型的辣椒无菌苗生长也有较大差异，这可能与不同品种的发育快慢有关（蔡文，2018）。李伟等（2014）研究发现，不同苗龄的朝天椒子叶外植体，其芽分化率差别较大，随着子叶外植体苗龄的增大，不定芽分化率呈先增大后减小的趋势。子叶诱导、分化能力以苗龄14 d 时最强，且能不经愈伤而直接诱导形成不定芽。本试验采用苗龄10 d 的幼苗制备外植体时，不定芽分化率较高，再生效果较好。

3.2 不同激素配比对辣椒不定芽分化的影响

影响辣椒离体再生的因素有多个方面，首先，不定芽的诱导和分化起着关键作用；其次，不定芽的伸长是离体再生过程中的重难点。多数研究认为6-BA、IAA 等激素对芽分化有诱导作用。高艺等（2021）用5.0～9.0 mol · L-16-BA + 0.05 mol · L-1IAA 诱导分化，子叶的分化率高达100%，用5.0～9.0 mol · L-16-BA 与3.0～9.0 mol · L-1ZT 配比组合，离体子叶再生形成的叶状体大部分呈玫瑰花瓣状，少部分呈正常长条形，且生长速度较快。钟源源等（2019）发现NAA 与6-BA 相配合可协同促进不定芽分化，通过优化试验得到高辣度辣椒不定芽分化最优的培养基组合为MS + 2.5 mol · L-16-BA + 0.05 mol · L-1NAA + 5 mol · L-1AgNO3，平均诱导率达93.3%。张根莲等（2019）以子叶和下胚轴为外植体，在添加1.0 mol · L-1IAA + 5.0 mol ·L-16-BA 的基础上再添加2.0 mol · L-1ZT，可加快诱导外植体的分化，但形成的叶状体呈簇状生长，后期导致不定芽伸长困难，由此说明ZT 对不定芽分化无明显促进作用。覃芳（2016）认为最适合诱导芽的植物生长调节剂组合是3 mol · L-16-BA + 0.8 mol · L-1NAA。由此可见，较高浓度的6-BA（3～6 mol · L-1）在辣椒不定芽诱导分化过程中起着重要作用。本试验采用6.0 mol · L-16-BA + 1.0 mol · L-1IAA 诱导再生芽分化，可得到80%以上的分化率。此外，蔡文（2018）以辣椒59 号的子叶、带柄子叶、下胚轴和Flamingo-bill 为外植体，发现Flamingobill 外植体不定芽分化率最高（85%），子叶和带柄子叶容易形成簇状芽，下胚轴容易出现生根现象，后期茎伸长培养困难，这与本试验过程中遇到的问题相似。

3.3 不同外植体对辣椒不定芽诱导率的影响

近年来辣椒离体再生所用的外植体大致为子叶、带柄子叶、上胚轴、下胚轴、茎尖、真叶和Flamingo-bill，不同外植体的不定芽诱导率差异较大。王佳伟（2022）以观赏辣椒子叶、带柄子叶、下胚轴为外植体，筛选出最佳外植体类型为带柄子叶，愈伤组织诱导能力强弱依次为带柄子叶 ＞ 子叶 ＞ 下胚轴。康瑜（2013）研究发现3 种外植体的分化能力从强到弱依次为Flamingo-bill ＞ 下胚轴 ＞ 带柄子叶。罗红萍（2010）和蔡文（2018）认为分化能力从强到弱依次为Flamingo-bill ＞ 带柄子叶 ＞ 子叶。曹艳玲（2009）和徐建中等（2015）研究发现，不同外植体芽分化率呈现带柄子叶 ＞子叶块 ＞ 下胚轴。本试验中，不定芽分化率呈现Flamingo-bill ＞ 子叶 ＞ 下胚轴，由于Flamingobill 保留了一片子叶和胚根，极大程度减少了外植体的损伤，同时能够产生大量的营养物质和生长激素，能够保证不定芽的形成，而子叶外植体容易形成簇状芽，较难伸长，下胚轴容易出现生根现象，因此外植体的选择对不定芽诱导有至关重要的影响。

3.4 不同激素配比对辣椒不定芽伸长的影响

不定芽伸长是离体再生的关键，但多数研究发现辣椒不定芽伸长尤为困难。大多数学者认为在伸长培养基中加入GA3可以促进不定芽伸长，同时通过降低6-BA 浓度、增加IAA 浓度对不定芽伸长效果也有一定影响。Gammoudi 等（2018）研究发现用GA3处理辣椒8 号，子叶诱导率为33.5%，下胚轴诱导率为62.6%。徐建中等（2015）和臧顺（2014）认为在MS 培养基中添加2.0 mol · L-1GA3促进芽伸长的效果最好，当GA3水平达到4.0 mol ·L-1时，不定芽伸长率反而降低，伸长的不定芽细长瘦弱，不易生长为正常植株，可能是GA3在体内累积过多引起的。本试验中，在含有6-BA、IAA 和GA3组合中，不定芽伸长率随着6-BA、GA3浓度升高而增加，在3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol · L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3时，不定芽伸长率最高。同时，不同外植体的不定芽伸长效果有明显差异，Flamingo-bill 外植体不定芽伸长率最高达到66.7%，明显大于子叶外植体不定芽伸长率，这可能是由于Flamingo-bill 外植体留下的子叶与胚根能产生大量的营养物质和生长调节激素，而顶端分生组织也会产生大量的调节激素，从而有利于愈伤组织分化和促进不定芽形成（高玉尧 等，2014）。

3.5 不同激素配比对辣椒不定芽生根的影响

辣椒不定芽生根相对容易，本试验发现，Flamingo-bill 外植体在不添加任何激素的MS 培养基中，不定芽能正常生根。子叶外植体形成的不定芽在添加少量的NAA 或者搭配IAA 使用的MS 培养基中能得到较好的生根效果。

4 结论

本试验建立了绿皮羊角椒9931 Flamingo-bill和子叶外植体的高效离体再生体系，其不定芽分化的最适培养基为MS + 6.0 mol · L-16-BA + 1.0 mol ·L-1IAA + 5.0 mol · L-1AgNO3，Flamingo-bill 和子叶诱导率分别为100.0%和86.7%；不定芽伸长的最适培养基为MS + 3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol ·L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3+ 5.0 mol · L-1AgNO3，Flamingo-bill 和子叶不定芽伸长率分别为66.7%和30.0%；不定芽生根的最适培养基为MS + 0.5 mol ·L-1NAA，生根率均为100.0%。