绿豆象成虫对红豆与绿豆种子挥发物的电生理和嗅觉行为反应

樊楠楠, 黄金遇, 刘 松, 张 凯, 张仙红, 郑海霞

(山西农业大学植物保护学院, 太谷 030801)

植食性昆虫利用植物释放的气味物质可以准确找到寄主和产卵场所(钦俊德和王琛柱, 2001; Bruceetal., 2005)。如小菜蛾Plutellaxylostella对于十字花科植物中的芥子油苷有强烈的趋向产卵行为(朱经云, 2021);梨小食心虫Grapholithamolesta寄主挥发物中的叶醇和己酸丁酯是引诱该虫前来产卵的关键物质(李逸等, 2016);榆紫叶甲Ambrostomaquadriimpressum也可以对寄主植物榆树挥发物产生趋向(Wangetal., 2017);枣树挥发物棕榈酸甲酯和壬醛对枣飞象Scythropusyasumatsui有显著的引诱作用(阎雄飞等, 2020);中华弧丽金龟甲Popilliaquadriguttata的寄主挥发物中β-石竹烯、芳樟醇和2-乙基-1-己醇对其有一定的吸引作用(徐伟等, 2018);蓝桉叶片中的α-水芹烯、α-蒎烯和α-法尼烯不仅能显著增加棉铃虫Helicoverpaarmigera抱卵雌蛾在叶片上的着陆频率,且产卵数量显著提高(孙小旭等, 2018)。

不同植物的挥发物均以特定的成分和比例构成独有的化学指纹谱,对昆虫精准寄主定位非常重要(Bruceetal., 2005; 阎雄飞等, 2020)。随着越来越多的植物挥发物有效成分被鉴定,植物源引诱剂也在多种害虫的治理中得到广泛应用,如蒎烯和蒈烯混合制成的诱芯对田间褐梗天牛Arhopalusrusticus有很高的诱集率(张霖等, 2016);肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸合成的混合物可作为四纹豆象Callosobruchusmaculatus的短程引诱剂(Adhikaryetal., 2016);单萜烯、松节油和乙醇等物质混配研制的M99-1型松墨天牛引诱剂对松墨天牛Monochamusalternatus有很好的引诱效果(赵锦年等, 2001);李晓峰等(2020)以7种植物挥发物单体设计筛选出了3种引诱剂配方对华北大黑鳃金龟成虫Holotrichiaoblita具有显著引诱效果;另外,华北大黑鳃金龟雄虫后肠粗提物顺-9-十八烯醛与榆树挥发物2-乙基-1-己醇混合比例为3∶1时,对华北大黑鳃金龟雌雄成虫均有极显著的引诱作用(李雪等, 2018)。

绿豆象Callosobruchuschinensis是一种常见的豆类储粮害虫,尤其对红豆和绿豆为害最重。成虫既可以在田间嫩豆荚上产卵,也可以在仓储豆类的种子表面产卵,幼虫孵化后蛀入豆粒为害,被蛀食的豆粒一般呈中空,种内成粉末状,破坏其发芽能力,对绿豆生产带来巨大的经济损失(邓芸等, 2008;曾琛和杨波, 2015)。不论是在田间还是仓储,绿豆象在寻找寄主产卵为害过程中,其嗅觉起着关键作用,因此利用植物源引诱剂对其进行嗅觉识别干扰是目前对其防控的有效手段。本研究对红豆和绿豆种子的挥发性化合物进行了收集、鉴定和分析,通过触角电生理反应和嗅觉行为反应试验筛选对绿豆象具有引诱活性的化合物及最佳配比,为开发绿豆象的植物源引诱剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试种子:所用种子品种为红豆汾小豆3号和绿豆晋绿1号,均是在山西农业大学农作站种植收获而来,将其脱粒自然晒干并保存,保持含水量在14%以下。

1.1.2供试昆虫:本试验所使用的供试昆虫来自山西农业大学害虫防治重点实验室,饲养温度(26±1) ℃,相对湿度75%±5%,光周期16L∶8D。

室内测试前,将当天羽化的成虫挑出,选择个体大小基本一致、虫体完整、健康活跃的绿豆象成虫供试。

1.1.3供试挥发性化合物:基于固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)及气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry GC-MS)鉴定的结果,选用相对含量较高且已通过触角电位(electroantennogram, EAG)初筛的8种红豆和绿豆共有的挥发性化合物进行试验。标准化合物如表1所示。

表1 供试8 种挥发性化合物的名称、纯度和来源

1.2 红豆和绿豆种子挥发物的采集与鉴定

采用SPME装置(50/30 μm DVB/CAR/PDM萃取纤维头,美国Supel公司)收集挥发物。将20 mL顶空进样瓶(美国安捷伦公司)用蒸馏水洗净烘干,分别用75%酒精、正己烷依次进行润洗,放入烘箱中40 ℃下烘干8 h。分别称取3 g洗净磨碎的红豆和绿豆种子放入顶空进样瓶中采集40 min,用空进样瓶作空白对照,实验重复3次。

采用美国Themo公司的Trace ISQ质谱联用仪(gas chroatography-mass spectrometry, GC-MS)对两种干豆子的挥发物进行分析鉴定,用 NIST谱库进行检索和匹配,结合标准品质谱图和保留时间对挥发性化合物进行定性分析,用峰面积归一法计算每种挥发性化合物的含量。气相色谱条件:色谱柱型号为DB-5MS,无分流进样,1 μL/次,载气为高纯氦气,进样口温度230 ℃;升温程序:初始值为75 ℃保持2 min,然后以5 ℃/min的速度升至280 ℃,保持5 min。质谱条件:电离方式EI,轰击电压70 eV,检测器温度300 ℃,离子源温度为230 ℃,四级杆温度150 ℃,接口温度为230 ℃,扫描速度5 s,扫描范围45～500 m/z。

1.3 触角电位测定

EAG反应测试采用李广伟等(2022)的方法,并做适当的改进。取健康活跃的绿豆象成虫,将触角用小刀从基部切下,并切去触角端部的1节鞭节,供试触角长度约为3 mm,然后将触角两端用导电胶(SpectraR 360)连接在两个电极上,再将其连接到交/直流放大器(Syntech UN-06)上,用透明玻璃管罩住,保证其处于一个稳定环境,利用 Spike 软件(Syntech 公司)进行数据采集和分析。用移液枪吸取10 μL测试样品均匀滴到事先剪好的滤纸条(50 mm×40 mm),用镊子将其装入巴斯德管内,然后将巴斯德管口垂直对准试虫触角,其与触角相距约为 1 cm。同样取10 μL石蜡油滴加于滤纸上作为对照。检测时,连续气流(500 mL/min)吹向离体触角,待基线平稳后开始测定。将待测质分别溶于石蜡油中,配制成浓度分别为10, 100, 250, 500和750 μg/μL的供试药剂,以石蜡油为对照。按照对照与样品循环刺激顺序,样品浓度依次增大进行试验,重复3次,每个处理测定8根触角,每个样品刺激0.5 s,刺激间隔大于60 s,保证触角完全恢复,减少误差。

EAG反应相对值计算公式:V=R-(V1+V2)/2,R代表待测样品的EAG反应相对值,V1和V2代表待测样品刺激前、后2次石蜡油引起EAG反应相对值。

1.4 室内嗅觉选择行为反应测定

根据 EAG 测试结果,选择反应强烈的4种挥发性化合物,配制成浓度分别为10, 100, 250, 500和750 μg/μL的供试药剂,以石蜡油为对照,利用Y型嗅觉仪进行室内单组分行为反应。Y型嗅觉仪由玻璃管制成,主臂长为25 cm,侧臂均为15 cm,两侧臂夹角为60°。用自制纸板箱将Y型嗅觉仪包围,纸板箱后部设置有昆虫入口和观察口,在纸箱顶部放置一个7 W的LED灯管(32 cm长),保证Y型嗅觉仪两臂光照相同。将Y型嗅觉仪、味源瓶、气体流量计、蒸馏水加湿瓶、活性炭过滤瓶和大气采样仪利用硅胶管依次连接,将气体流速控制在250～300 mL/min。测试前,分别将滴有10 μL待测样品和石蜡油的滤纸条(50 mm×40 mm)置于两个味源瓶中。每测试30 min更换一次味源瓶中和对照瓶的滤纸条。每次将绿豆象成虫释放到主臂的同一起始位置,让其自由爬动,通过观察口观察其行为。每次释放1头成虫,当绿豆象成虫第1次爬过 Y 型嗅觉仪的左臂或右臂超过1/3处并停留30 s以上视为作出选择;若试虫5 min后没有做出选择,则视为无反应。每个处理绿豆象雌、雄成虫各20头,试虫不重复使用,雌雄成虫分开测试,防止性别之间产生影响。每个处理重复3次。

根据单组分室内行为反应结果,剔除对绿豆象具有驱避效果的组分,将其余3种具有引诱作用的化合物进行混配试验,混配时根据单体化合物在GC-MS结果中所占的比例将3种化合物配成三元、二元混合物,其中每个单体化合物的含量按照比例放大10, 100, 250, 500和1 000倍进行触角电位实验筛选(另文发表),结果显示放大100和250倍时反应较强烈,因此选择放大200倍作为每个单体化合物的含量,混配方案如表2。

表2 引诱剂配方的组分及含量

Y型嗅觉仪的测试中行为反应的计算公式:反应率(%)=[(选择味源总虫数+选择对照总虫数)/测试总虫数]×100;选择率(%)=[选择味源总虫数/(选择味源总虫数+选择对照总虫数)]×100。

1.5 数据分析

利用SPSS 24.0软件对实验数据进行统计分析;利用独立样本t检验分析两种豆子中同一挥发物相对含量的差异性;采用单因素方差分析结合Duncan氏多重比较法分析同一物质不同浓度之间的EAG反应相对值的差异显著性;利用χ2检验分析成虫选择气味源和选择对照的差异显著性。

2 结果

2.1 红豆和绿豆种子挥发物分析鉴定

GC-MS分析结果显示,红豆和绿豆两种豆类种子中共有挥发物18种(相对含量均>0.5%),主要包含4种醇类、3种醛类、3种烷烃类、2种芳香烃类、2种酮类、1种酯类、1种烯烃类、1种萘和1种肟,共有成分在两种豆子中的相对含量均没有显著差异(P>0.05)(表3)。

表3 红豆和绿豆种子共有挥发性化合物成分及相对含量

表中数据为平均值±标准误;同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05,t检验);2种样品相对含量均低于0.5%的化合物未列入表中。Data in the table are mean±SE. Different small letters following the data in the same row indicate significant difference (P<0.05,t-test). The compounds present in the two samples with a relative content of less than 0.5% are not listed in the table.

2.2 绿豆象成虫EAG反应

绿豆象成虫触角对红豆和绿豆种子中8种共有挥发物的EAG反应见表4。从表中可以看出甲基庚烯酮、己醛、正壬醛和癸醛均能引起绿豆象强烈EAG反应,而正癸烷、反式石竹烯、2-甲基萘和环己基苯引起的EAG反应相对微弱。绿豆象雌成虫在浓度为500 μg/μL甲基庚烯酮的刺激下EAG反应相对值最大,为1.620 mV,显著高于其他低浓度引起的EAG反应相对值(P<0.05),但与750 μg/μL时引起的EAG反应相对值差异不显著(P>0.05),而雄成虫在750 μg/μL时EAG反应最为强烈,最大值为1.366 mV,极显著高于10 μg/μL时引起的EAG反应相对值(P<0.01),但与其他浓度引起的EAG反应相对值差异不显著(P>0.05);雄成虫对750 μg/μL己醛的EAG反应相对值最大,为2.020 mV,但雌成虫达到最大EAG反应相对值的浓度为500 μg/μL, 最大值为1.380 mV。癸醛和正壬醛在浓度750 μg/μL均能引起绿豆象雄成虫表现出强烈EAG反应。在500 μg/μL时,雌成虫对癸醛和己醛的EAG反应相对值达到最大,继续增加浓度达到750 μg/μL时EAG反应相对值却有所减小。

表4 绿豆象雌雄成虫对红豆和绿豆种子不同浓度的8种挥发性化合物的触角电位(EAG)反应

2.3 绿豆象成虫对挥发物的室内嗅觉选择行为反应

2.3.1绿豆象成虫对单组分物质的嗅觉选择行为反应:选取EAG反应相对值较高的挥发物对绿豆象进行室内行为反应,结果见图1所示。4种化合物不同浓度对绿豆象雌雄成虫的行为反应存在差异,在浓度为10和100 μg/μL时,4种化合物对绿豆象两性成虫均无明显定向作用。500和750 μg/μL时甲基庚烯酮对绿豆象雌、雄成虫有显著的引诱作用,而250 μg/μL时仅对雌成虫表现出显著的引诱作用(P<0.05)(图1: A, B);癸醛在浓度为250, 500和750 μg/μL时对绿豆象雌成虫的引诱效果表现出显著差异(P<0.05),仅在浓度为750 μg/μL时对绿豆象雄成虫有显著的引诱效果(P<0.05)(图1: C, D); 500 μg/μL正壬醛对绿豆象雌、雄成虫均有显著的引诱作用(P<0.05),但是,在浓度为250 μg/μL时仅极显著地吸引绿豆象雌成虫(P<0.01),在浓度为750 μg/μL时极显著地吸引绿豆象雄成虫(P<0.01)(图1: E, F);己醛对绿豆象两性成虫具有明显的驱避效果,且浓度越高驱避效果越明显(图1: G, H)。

图1 绿豆象成虫对不同浓度4种挥发性化合物的嗅觉行为反应率

2.3.2绿豆象成虫对多组分物质的嗅觉行为反应:多组分物质的室内行为反应表明,配方A, B和D对绿豆象两性成虫的引诱虫数均显著高于对照(石蜡油)(P<0.05),其中配方B有极显著的引诱效果(P<0.01),而配方C与对照的引诱作用无显著差异(P>0.05)(图2: A, B)。绿豆象雌雄成虫对4个配方的反应率均高于80%,其中绿豆象雌成虫对配方B的选择率为90.51%,显著高于对其他配方的选择率(P<0.05),而绿豆象雄成虫对配方B的选择率为75.88%,显著高于配方A和C(P<0.05),但与对配方D的选择率无显著差异(P>0.05)(表5, 6)。

图2 绿豆象雌(A)雄(B)成虫对不同配方的嗅觉行为反应

表5 绿豆象雌成虫对4种配方的嗅觉行为反应

表6 绿豆象雄成虫对4种配方的嗅觉行为反应

3 讨论

本研究对绿豆和红豆种子挥发物进行了分析鉴定,在两种豆类的共有挥发物中筛选获得甲基庚烯酮、正壬醛、癸醛和己醛4种物质均能引起绿豆象强烈电生理反应,且总体随浓度增大反应呈增强趋势,说明 4种物质对绿豆象成虫有引诱或驱避活性(表4)。在这4种挥发性化合物中有3种属于醛类化合物,分别是己醛、壬醛和癸醛,研究表明3种醛类物质均能引起多种昆虫的电生理反应,据唐睿等(2012)报道,壬醛和己醛能够引起重大林业入侵害虫美国白蛾Hyphantriacunea雌、雄成虫较高电生理反应;相会明等(2020)研究发现梨小食心虫雌蛾对壬醛的 EAG 反应值较高;又如王延来等(2020)发现正癸醛能够引起花椒窄吉丁Agriluszanthoxylumi雌虫和雄虫最大的 EAG 反应值,以上研究与我们研究结果一致。在两种豆类挥发物中同时存在且相对含量较高的甲基庚烯酮同样能够引起绿豆象成虫较高的 EAG反应,龙登隆(2019)也研究发现该物质能够引起中华蜜蜂Apiscerana强烈电生理反应,且随着浓度增高而增强;董喆(2011)从亚洲小车蝗Oedaleusdecorusasiaticus的末龄蝗蝻体表挥发物中提取到甲基庚烯酮,并对其引诱效果研究发现,该物质对雄性幼成虫均具有显著吸引作用。另外,本研究还发现绿豆象雌成虫相对于雄虫 EAG 反应值更高,推测可能是雌虫需要寻找适合产卵场所以满足自身及后代营养需求,对植物挥发物化学信息更加敏感,而性信息素才会对雄虫有强烈的引诱作用,这种差异在鞘翅目(Ballhornetal., 2013)、双翅目(Hern and Dorn, 2004)和鳞翅目(Corneliusetal., 2001)等植食性昆虫上均有报道。

昆虫的触角电位反应仅表示昆虫对挥发性物质的敏感程度,行为实验才能确定挥发性物质的具体作用(Cooketal., 2007)。本研究行为趋性试验结果表明,绿豆象对甲基庚烯酮、正壬醛和癸醛有明显的引诱作用,对己醛具有显著驱避效果(图1)。类似的研究报道也较多,如陈艳萍等(2016)通过行为试验发现正壬醛对槐绿虎天牛Chlorophorusdiadema有明显的引诱作用;贾小俭等(2017)发现壬醛对甘薯蚁象Cylasformicarius有较好的引诱作用;刘永梅等(2020)研究表明癸醛能够显著引诱飞蝗Locustamigratoria雌虫;毛祥忠等(2020)发现己醛对西藏簇角缨象天牛Caciacretifera雌、雄成虫有驱避作用。以上研究结果说明这些醛类化合物是属于广谱性的引诱或驱避物质,在众多植食性昆虫的寄主定位过程中发挥重要作用。

昆虫一直生活在多种气味背景的化学环境中,对特定组合的植物挥发物感受相对于单一化合物的感受更加敏感(蔡晓明等, 2020)。在室内多组分行为反应试验中,配方A, B和D相比较单一组分都表现出显著的引诱效果,其中配方B对绿豆象的引诱效果最佳(图2; 表5,6)。这对研究开发绿豆象植物源引诱剂有一定的参考价值,但今后还需进行仓储引诱实验进一步验证和筛选。另外,本研究证实癸醛是具有引诱活性的单组分物质,但在有癸醛的配方中引诱效果不佳,可能的原因需要进一步分析。

研究表明寄主植物挥发物中微量的化学物质也可能对植食性昆虫的行为起关键作用(Pieroetal., 2008),本研究只选择含量较高的挥发性化合物进行测试,可能有一些含量较低但非常重要的组分未被发现,在今后的研究中将针对这些微量物质进行筛选,同时结合实验室前期筛选的豆荚挥发物活性物质对绿豆象进行联合仓储引诱实验,为开发绿豆象行为调控剂提供理论依据。