ZNF224和DEPDC1在肺腺癌中的表达及其临床意义

张婧, 杨丹, 陈思言

南充市中医医院内一科,四川南充637000

肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)的一种,其发病率逐年升高,早期无明显症状,就诊时多为中晚期,预后较差[1-2]。因此,寻找与肺腺癌患者预后相关的指标,对临床制定干预措施,延长患者生命有积极意义。研究表明,LUAD发生发展与信号转导、癌基因激活、自噬等有关[3-4]。近期报道显示,DEP结构域蛋白1(DEP domain containing 1,DEPDC1)在LUAD中呈高表达,与LUAD患者不良预后相关[5]。过表达锌指蛋白224(zinc finger protein224,ZNF224)可促进黑色素瘤细胞增殖、侵袭[6];DEPDC1可通过与ZNF224相结合,进而激活核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)信号通路,从而影响肝癌的病理过程[7]。本文测定ZNF224、DEPDC1在LUAD患者中的表达,分析二者相关性及其与LUAD患者预后的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2014年5月—2018年9月本院收治的LUAD患者73例,年龄43～74岁,平均(59.13±11.27)岁;男42例,女31例;肿瘤直径≥5 cm 45例,<5 cm 28例;吸烟39例,未吸烟34例;TNM分期[8]:Ⅰ～Ⅱ期41例,Ⅲ～Ⅳ期32例;<60岁33例,≥60岁40例;中、高分化51例,低分化22例;表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)表达阳性35例,阴性38例;淋巴结未转移者30例,转移者43例。本研究经本院伦理委员会批准,且符合《赫尔辛基宣言》。

纳入标准:①患者符合LUAD判定标准[9],且经术后病理学确诊;②受试者或其家属签署知情同意书。排除标准:①转移性肺癌;②临床资料不全;③有放化疗史;④严重肝肾功能不全。

1.2 Ualcan数据库检索

运用Ualcan数据库(http://ualcan.path.uab.edu)检索LUAD组织和正常肺组织ZNF224、DEPDC1 mRNA表达。gene symbol为ZNF224、DEPDC1在TCGA数据集中选择肺腺癌进行检索所得。

1.3 组织标本收集

收集患者经手术切除的LUAD组织及癌旁组织(距肿瘤边缘3 cm处的肺组织),剪取一部分,置于福尔马林中固定,制备石蜡切片;另一部分迅速置于液氮中,24 h后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 qRT-PCR检测ZNF224、DEPDC1 mRNA表达

研碎冻存的LUAD组织和癌旁组织,以TRIzol Reagent(15596018,美国GIBCO公司)获得组织总RNA,以RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622,上海恒斐生物科技有限公司)获取组织cDNA;利用HieffTTMqPCR SYBR® Green Master Mix(YB11201ES03,上海钰博生物科技有限公司)、qRT-PCR仪(StepOne TM,美国ABI公司)扩增cDNA,读取循环阈值(CT值)。97.8 ℃ 6 min,96 ℃ 20 s,63 ℃ 20 s,62.5 ℃ 15 s,40个循环。GAPDH作为内参,引物序列ZNF224上游为5′-GACAGCAATCCAAAGGGAAGGG-3′,下游为5′-CAGATTTGCTGGAAGGACCACTC-3′。引物序列DEPDC1上游为5′-CTCGTAGAACTCCTAAAAGGCATG-3′,下游为5′-CAACATCTTCCTGGCTTAGTTCTC-3′。引物序列GAPDH上游为5′-AGAGAGCAGGCTCATTGTG-3′,下游为5′-GCAGGCCAGGGATCGAATGAT-3′。ZNF224、DEPDC1 mRNA相对表达量以2-ΔΔCT法计算。

1.5 免疫组化法检测ZNF224、DEPDC1蛋白表达

取4 μm厚石蜡切片,SP法染色,依据免疫组化试剂盒说明书进行常规操作,一抗为ZNF224抗体(CSB-PA026592LD01HU,美国Cusabio公司)、DEPDC1抗体(ab197246,英国abcam公司),经显色、复染、脱水、封片后在显微镜(Leica DVM6,德国徕卡公司)下拍照。按染色程度(A)与阳性细胞比例(B)评分乘积判定ZNF224、DEPDC1蛋白表达情况:以A×B≥3分为阳性,否则为阴性[10]。

1.6 随访

73例LUAD患者均随访36个月,以LUAD患者手术当天为随访起点,以LUAD患者死亡或随访至2021年9月为随访终点,以门诊或电话为主要随访方式,记录LUAD患者生存情况。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料采用配对t检验,计数资料采用χ2检验。Pearson相关性分析LUAD组织中ZNF224 mRNA及蛋白表达分别与DEPDC1 mRNA及蛋白表达的相关性。Kaplan-Meier生存曲线法分析LUAD组织ZNF224、DEPDC1 mRNA表达与LUAD患者预后的关系。COX回归法分析LUAD患者预后的影响因素。α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 Ualcan数据库检索结果

Ualcan数据库检索显示,LUAD组织ZNF224、DEPDC1 mRNA表达均高于正常肺组织(P<0.05;图1)。

图1 Ualcan数据库检索结果a为P<0.05,与正常肺组织比较。

2.2 LUAD组织、癌旁组织ZNF224、DEPDC1 mRNA及其蛋白表达情况

与癌旁组织相比,LUAD组织ZNF224、DEPDC1 mRNA表达升高(P<0.05;表1)。免疫组化显示,ZNF224主要定位于细胞质/核,DEPDC1定位于细胞核(图2)。LUAD组织ZNF224、DEPDC1蛋白表达阳性率均高于癌旁组织(P<0.05;表2)。

表2 LUAD组织、癌旁组织ZNF224、DEPDC1蛋白表达情况(n=73) 例(%)

图2 LUAD组织ZNF224及DEPDC1蛋白表达情况(免疫组化法,200×)A为ZNF224蛋白表达阴性;B为ZNF224蛋白表达阳性;C为DEPDC1蛋白表达阴性;D为DEPDC1蛋白表达阳性。

2.3 LUAD组织ZNF224、DEPDC1 mRNA及其蛋白表达与临床病理特征关系

分别以LUAD组织中ZNF224、DEPDC1 mRNA相对表达量平均值2.29、2.35为临界值,≥临界值者分别为ZNF224 mRNA高表达组(37例)、DEPDC1高表达组(39例),<临界值者分别为ZNF224 mRNA低表达组(36例)、DEPDC1低表达组(34例)。结果显示,LUAD组织TNM分期、分化程度、淋巴结转移,ZNF224低表达组与高表达组、DEPDC1低表达组与高表达组比较,差异均有显著性(P<0.05;表3、表4)。

表3 LUAD组织ZNF224、DEPDC1 mRNA表达与临床病理特征关系 例(%)

表4 LUAD组织ZNF224、DEPDC1蛋白表达与临床病理特征关系 例(%)

2.4 LUAD组织ZNF224与DEPDC1的相关性

LUAD组织ZNF224 mRNA与DEPDC1 mRNA呈正相关(r=0.569,P<0.05),ZNF224蛋白与DEPDC1蛋白呈正相关(χ2=27.455,P<0.05)。

2.5 LUAD组织ZNF224、DEPDC1 mRNA表达与LUAD患者预后的关系

73例LUAD患者存活49例,死亡24例,生存率67.12%。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,ZNF224 mRNA低表达组LUAD患者的平均生存时间34.69个月(95%CI:33.45～35.94),长于ZNF224 mRNA高表达组28.43个月(95%CI:25.53～31.34);DEPDC1 mRNA低表达组LUAD患者的平均生存时间34.53个月(95%CI:32.99～36.07),长于DEPDC1 mRNA高表达组28.90个月(95%CI:26.17～31.63)。Log-Rank检验结果显示,ZNF224、DEPDC1 mRNA高、低表达组LUAD患者的累积生存率相比,差异均有统计学意义(P<0.05;图3)。

图3 LUAD组织ZNF224、DEPDC1 mRNA表达与LUAD患者预后的关系

2.6 COX回归分析LUAD患者预后的影响因素

单因素及多因素COX回归分析结果显示,TNM分期、ZNF224、DEPDC1 mRNA、淋巴结转移是影响LUAD患者不良预后的独立危险因素(P<0.05;表5)。

表5 影响LUAD患者预后的单因素和多因素COX回归分析

3 讨 论

LUAD起病隐匿,多数患者早期仅出现胸闷、咳嗽等症状,患者就诊时多已错失最佳治疗时机[11]。此外,LUAD具有高度异质性,其病变过程涉及多种信号通路改变[12],因此,仍需寻找可早期诊断LUAD、评估LUAD患者预后的标志物。

DEPDC1的基因位于染色体1p31.2,其可参与信号转导,影响肿瘤细胞增殖,与胃癌、大肠癌等关系密切[13-14]。研究发现,DEPDC1在NSCLC中表达失调,与NSCLC患者预后有关[15];另外,DEPDC1在LUAD中呈过表达,其可能激活上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程进而参与LUAD发生发展[16]。本文中LUAD组织DEPDC1 mRNA表达较高,与Li等[16]结果相符,且LUAD组织DEPDC1表达阳性率较高,提示DEPDC1可能与LUAD密切相关,推测DEPDC1可能通过影响EMT,调节信号转导过程,进而影响LUAD病理过程。

ZNF224调节细胞因子分泌,与肿瘤的发生发展有关[17-18]。研究发现,ZNF224在慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)中呈高表达,可能是治疗CLL的潜在靶标[19];另外,ZNF224在多发性骨髓瘤中表达升高,在多发性骨髓瘤中发挥促癌作用[20]。本研究中LUAD组织ZNF224 mRNA表达较高,与Ualcan数据库检索结果相符,且LUAD组织ZNF224表达阳性率高于癌旁组织,提示ZNF224可能与LUAD病理发展相关,推测过表达ZNF224可能通过影响血管内皮生长因子等分泌,激活相关信号通路,进而促进LUAD病理变化,但其机制有待深入探讨。本文中ZNF224 mRNA低表达组LUAD患者累积生存率高于ZNF224 mRNA高表达组,DEPDC1 mRNA高表达组LUAD患者累积生存率低于DEPDC1 mRNA低表达组,提示DEPDC1、ZNF224可作为评估LUAD患者预后的辅助标志物。

Pearson相关性结果显示,ZNF224 mRNA及其蛋白表达分别与DEPDC1 mRNA及其蛋白表达呈正相关,提示ZNF224可能与DEPDC1协同影响LUAD病情进程。COX回归分析结果显示,ZNF224 mRNA、DEPDC1 mRNA、TNM分期、淋巴结转移均可能增加LUAD患者发生不良预后的风险,及时测定ZNF224、DEPDC1表达有助于临床诊治LUAD、评估LUAD患者预后。

综上,LUAD组织中ZNF224、DEPDC1上调,ZNF224与DEPDC1呈正相关,且均与LUAD患者预后关系密切,有望作为评估LUAD患者预后的潜在标志物。