辛伐他汀抑制川畸病大鼠心肌损伤

姜虹羽, 庄秀娟, 蔡思铭, 岑红霞

海南医学院第二附属医院儿科二区,海南海口570311

川崎病(Kawasaki disease,KD)又名皮肤黏膜淋巴结综合征,在急性发作期体内的免疫细胞被过度激活,形成炎症因子风暴,诱导心肌细胞凋亡,导致心肌损伤,进而引起心肌纤维化从而降低心肌顺应性[1-2]。辛伐他汀可以减轻缺血再灌注所引起的大鼠心肌细胞损伤,抑制心肌细胞凋亡,提升心肌细胞代谢活性从而改善心功能[3-4]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)被分泌到细胞外后可引起强烈的促炎作用,与组织细胞表面晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)高亲和力结合,诱导细胞发生凋亡[5-6]。既往研究证实HMGB1的表达与心肌损伤密切相关[7]。然而,辛伐他汀是否对川崎病诱导的心肌损伤具有保护作用目前仍未可知。本研究探讨辛伐他汀对川崎病大鼠心肌的影响及机制,为川崎病诱导的心肌损伤提供新的诊疗方案。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

干酪乳酸杆菌、细菌肉汤培养基购自上海微生物保种公司;SDS裂解液购自上海碧云天生物科技公司;RNA酶、DNA酶、蛋白酶抑制剂购自上海生工公司;肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnI)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒购自上海联科生物科技公司;HE染色试剂盒购自上海碧云天生物科技公司;抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、促凋亡蛋白Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、促凋亡蛋白活化的Caspase-3(cleaved-Caspase-3)、HMGB1、RAGE、GAPDH抗体购自美国Abcam公司。

1.2 实验动物及处理

4周龄SD雄性大鼠购自上海睿太莫斯生物科技有限公司;川崎病大鼠模型造模流程参考文献[8]。在37 ℃厌氧培养箱中使用肉汤培养基扩增干酪乳酸杆菌菌种5天;培养基8 000 g离心30 min,取沉淀细菌组分,加入SDS裂解液过夜裂解。8 000 g离心裂解液15 min,洗涤3次,加入5 mL RNA酶(100 mg/L)及5 mL DNA酶(100 mg/L)混合于37 ℃过夜孵育。次日,离心弃上清,洗涤3次获得细菌组分,将其置于超声细胞破碎仪中,冰浴条件下破碎10 min,洗涤3遍,最后利用高速离心机12 000 g低温离心2 h,弃去沉淀,所得上清即为川崎病大鼠模型造模溶液,将其稀释至1 g/L造模备用。

将24只SD大鼠随机均分为对照组、模型组和辛伐他汀组。对照组大鼠腹腔注射1 mL生理盐水;模型组大鼠腹腔注射KD造模溶液1 mL;辛伐他汀组大鼠腹腔注射KD造模溶液1 mL和辛伐他汀溶液(100 mg/kg)。辛伐他汀给药方式参照文献[9]。每日监测各组大鼠的存活情况。造模后28天结束动物实验并取材,检测相关指标变化情况。造模后可通过心脏超声及病理切片验证川崎病诱导的心肌损伤程度。

1.3 大鼠心脏功能检测

各组大鼠使用1.5%的异氟烷麻醉,仰卧位固定于小动物加热仪器,用除毛膏将大鼠左侧胸前毛发脱去,涂抹超声耦合剂,将探头放于左侧胸前,在乳头水平用M型取样线检测大鼠心率,并完整检测多个心动周期,分别在收缩期与舒张期测量左室内径等心脏结构参数,计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)及左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.4 HE染色

取大鼠心肌组织于4%多聚甲醛中固定过夜,采用常规石蜡包埋切片,脱蜡复水方式进行HE染色,光镜下观察心肌结构和炎症细胞浸润情况。

1.5 血清心肌损伤标志物检测

各组大鼠取材后收集主动脉血1 mL,3 000 r/min离心10 min,弃去沉淀收集血清,按照ELISA试剂盒说明书步骤检测血清中CK-MB及cTnI水平。

1.6 心肌组织炎症因子检测

取50 mg心肌组织放入研钵中,预冷的PBS清洗,加入ELISA实验裂解液(质量/体积比为1∶3),将心肌组织充分研磨15 min,12 000 g低温下离心20 min,弃去沉淀并收集上清进行后续检测。按照ELISA试剂盒要求加入各种试剂,采用酶标仪计算IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7 免疫印迹法

每只大鼠取50 mg心肌组织放入离心管,加入SDS裂解液提取总蛋白并测定蛋白含量。按照免疫印迹法操作流程,10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离蛋白,半干转法转膜,5%牛血清白蛋白溶液对膜进行室温封闭3 h。加入稀释好的一抗Bcl-2、Bax、cleaved-Cpaspase-3、HMGB1、RAGE(1∶1 000),与膜在4 ℃共孵育16 h过夜。次日,加入稀释好的二抗(1∶5 000)与膜共孵育1 h,后暗室显影并用Image J软件对蛋白条带进行灰度值定量分析。以目标条带和GAPDH内参条带的比值作为各组目标条带表达量,Image J分析灰度值。

1.8 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件处理数据。多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Dunnett检验。P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 辛伐他汀对各组大鼠心脏功能的影响

与对照组比较,模型组大鼠心肌损伤明显,LVEF及LVFS水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,辛伐他汀组大鼠心脏情况明显好转,LVEF及LVFS值恢复至正常水平(P<0.05;图1)。

图1 各组大鼠心脏超声结果A、B、C分别为对照组、模型组、辛伐他汀组大鼠心脏彩超结果;D为各组川崎病大鼠LVEF、LVFS值的柱状图。a为P<0.05,与对照组比较;b为P<0.05,与模型组比较。

2.2 辛伐他汀对大鼠心肌损伤及炎症水平的影响

HE染色结果显示,与对照组比较,模型组小鼠心肌组织可见心肌纤维断裂、心肌纤维化和炎症细胞浸润,而给与辛伐他汀治疗后心肌纤维断裂、纤维化及炎症细胞浸润明显减轻(图2)。与对照组比较,模型组大鼠CK-MB、cTnI、IL-1β、IL-6及TNF-α水平显著增高(P<0.05);与模型组比较,辛伐他汀组大鼠上述各指标水平显著降低(P<0.05;表1)。

表1 各组大鼠血清中CK-MB、cTnI及心肌组织中炎症因子水平比较(n=8)

图2 各组大鼠心肌组织HE染色结果(200×)A为对照组;B为模型组;C为辛伐他汀组。

2.3 辛伐他汀对各组大鼠心肌组织凋亡相关蛋白的影响

与对照组比较,模型组小鼠心肌组织中Bax、cleaved-Caspase-3表达明显升高,Bcl-2表达显著下降(P<0.05);与模型组比较,辛伐他汀组大鼠心肌组织Bax、cleaved-Caspase-3表达明显下降,Bcl-2显著升高(P<0.05,图3)。

图3 辛伐他汀对各组大鼠心肌细胞凋亡的影响1为对照组;2为模型组;3为辛伐他汀组。A为各组大鼠凋亡相关蛋白Western blotting结果;B为各组大鼠凋亡相关蛋白相对表达水平的柱状图。a为P<0.05,与对照组比较;b为P<0.05,与模型组比较。

2.4 辛伐他汀对各组心肌组织HMGB1/RAGE信号通路相关蛋白的影响

模型组小鼠心肌组织HMGB1、RAGE表达较对照组明显升高(P<0.05)。辛伐他汀组大鼠心肌组织HMGB1、RAGE表达较模型组明显降低(P<0.05,图4)。

图4 辛伐他汀对各组心肌组织HMGB1/RAGE信号通路相关蛋白的影响1为对照组;2为模型组;3为辛伐他汀组。A为各组大鼠HMGB1及RAGEWestern blotting结果;B为各组大鼠HMGB1及RAGE蛋白相对表达水平的柱状图。a为P<0.05,与对照组比较;b为P<0.05,与模型组比较。

3 讨 论

川崎病是儿童常患的一种出疹性急症,为儿童免疫性疾病中的诊疗难点[10]。非特异性血管炎症是川崎病的主要临床病理特点,对冠状动脉及其周围心肌组织损害更为严重,最终将导致心功能下降和冠状动脉瘤。本研究利用干酪乳酸杆菌提取物制备大鼠川崎病模型,通过观察辛伐他汀对川崎病诱发的心肌损伤的影响及相关分子机制,证实辛伐他汀可明显增强川崎病大鼠的心肌功能,提升LVEF与LVSF占比,同时抑制心肌细胞凋亡和炎症反应,从而实现保护心肌的作用。

辛伐他汀能降低胆固醇及低密度脂蛋白水平[11],也可缓解脂多糖诱发的全身炎症反应[12]。在心肌肥厚、糖尿病心肌病或心肌缺血再灌注损伤中通过调控腺苷酸活化蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶、核因子E2相关因子2等蛋白起到保护心肌的作用[13]。目前,辛伐他汀抑制炎症的作用机制尚存在争议。本研究结果显示,辛伐他汀可以显著抑制心肌细胞凋亡,同时也能减轻炎症细胞浸润和降低炎症因子水平。Bax、Bcl-2及Caspase-3是经典的线粒体途径介导的细胞凋亡相关蛋白,反映细胞凋亡的进程。辛伐他汀可调控内源性凋亡途径抑制成骨细胞凋亡,促进线粒体功能和成骨效果[14]。因此,线粒体凋亡途径可能是辛伐他汀发挥生理作用的重要机制。

HMGB1是促炎关键蛋白,和其特异性受体RAGE结合后会开启促炎信号通路,因此靶向二者的表达及结合能力为抗炎药物开发提供了全新的有效位点。研究发现,利用HMGB1的抗体可以有效缓解非酒精性脂肪肝中的肝脏炎症反应[15]。本研究结果显示,辛伐他汀能显著降低川崎病大鼠心肌组织中HMGB1及RAGE的表达量,降低炎症因子的表达和减少心肌细胞凋亡;提示辛伐他汀对心肌细胞损伤的保护作用可能与抑制HMGB1/RAGE信号通路功能有关。

综上所述,辛伐他汀可抑制川崎病导致的大鼠心肌损伤,其机制可能与抑制HMGB1/RAGE信号通路有关。