miR-519b-3p调控IL-6/STAT3通路对宫颈癌细胞凋亡、迁移、侵袭的影响

黄丽, 龚豪, 张春莲

十堰市太和医院 1.妇科,2.肾病内科,湖北十堰442000

宫颈癌是常见的妇科癌症之一,全球每年有60多万新增病例,并造成约34万女性死亡[1],宫颈癌进展和转移是宫颈癌患者的主要死亡原因,研究该机制可为宫颈癌治疗提供新见解。miRNA可调节基因表达,miRNA表达失调参与宫颈癌进展[2]。miR-519b-3p被认为是结直肠癌、肺腺癌的肿瘤抑制剂,其上调可降低肿瘤细胞增殖和侵袭能力,抑制肿瘤发生[3-4]。然而,miR-519b-3p在宫颈癌中的功能及其作用机制尚不清楚。白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是由免疫细胞、肿瘤细胞等产生的多效细胞因子,可激活IL-6/信号转导和转录激活因子3(signal transduction and transcription activating factor 3,STAT3)通路,促进肿瘤细胞的恶性生物学过程[5-6]。下调IL-6/STAT3通路可通过抑制宫颈癌细胞的上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和增殖、诱导凋亡来抑制宫颈癌进展[7-8]。据此,本研究以IL-6/STAT3通路为切入点,探讨miR-519b-3p对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响,以期为宫颈癌治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 标本、细胞和试剂

收集本院2020年3月—2022年3月63例宫颈癌手术患者(年龄48～68岁,其中宫颈鳞癌55例,宫颈腺癌8例)的宫颈癌标本及相应的癌旁组织,并置于-80 ℃保存。所有患者在术前未接受任何治疗,且签署书面知情同意书。本院医学伦理委员会批准了本研究。

宫颈癌SiHa细胞购自无锡欣润生物公司;TRIzol试剂、Annexin V-FITC/碘化丙啶细胞凋亡检测试剂盒、兔E-钙黏蛋白(E-cadherin)多抗(abs130068)购自上海爱必信生物公司;miRNA第一链cDNA合成试剂盒、miRNA通用SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物公司;miR-519b-3p模拟物及模拟物阴性对照(miR-NC)购自上海吉满生物科技公司;重组人IL-6(recombinant human IL-6,RhIL-6)蛋白(ab101044)、羊抗兔IgG(ab205718)、兔B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)多抗(ab196495)、兔STAT3多抗(ab226942)、兔p-STAT3单抗(ab267373)、兔Bcl相关x蛋白(Bax)多抗(ab263897)、兔GAPDH多抗(ab37168)、兔N-cadherin单抗(ab18203)购自上海艾博抗生物公司。

1.2 qRT-PCR检测miR-519b-3p表达

用TRIzol试剂分离宫颈癌组织和癌旁组织总RNA,用miRNA第一链cDNA合成试剂盒进行反转录,再用miRNA通用SYBR qPCR Master Mix进行qRT-PCR。miR-519b-3p上游引物5′-GGTCAAGTGACACCGTCG-3′,下游引物5′-TGCAGCTGGGGGTCAG-3′;U6上游引物5′-GTGATCACTCCCTGCCTGAG-3′,下游引物5′-GGACTTCACTGGACCAGACG-3′。采用2-ΔΔCT方法定量miR-519b-3p表达水平。

1.3 SiHa细胞培养和分组

采用含1%青霉素和链霉素、10%胎牛血清的DMEM,在37 ℃5%CO2培养箱孵育SiHa细胞。每周换液2～3次,1∶3传代。在24孔板中接种1×104个/孔对数期SiHa细胞,用Lipo2000将40 nmol/L miR-519b-3p模拟物、40 nmol/L miR-NC分别转染50%汇合度细胞,收集转染48 h的SiHa细胞。转染miR-519b-3p模拟物、转染miR-NC的SiHa细胞分别记为miR-519b-3p组、miR-NC组;用5 g/L RhIL-6[8]处理转染miR-519b-3p模拟物或转染miR-NC的SiHa细胞,分别记为miR-519b-3p+RhIL-6组、miR-NC+RhIL-6组。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组SiHa细胞,在预冷PBS中重悬,室温1 000 r/min离心5 min,然后用含5 μL AnnexinV-FITC和5 μL碘化丙啶的500 μL结合缓冲液重悬细胞,室温避光孵育15 min。通过流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.5 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭

将含10%胎牛血清的500 μL DMEM置于24孔板下室,将用无血清DMEM重悬的200 μL细胞悬液加入到包被(侵袭)或未包被(迁移)基质胶的Transwell板上室。培养24 h后,用甲醇固定迁移或侵袭细胞,0.1%结晶紫染色。在显微镜下观察细胞并计数。

1.6 Western blotting检测相关蛋白水平

用RIPA法提取细胞中总蛋白,通过SDS-PAGE分离等量蛋白质,然后将样品湿转到PVDF膜上。封闭膜后,与一抗(E-cadherin、STAT3和Bcl-2为1∶2 000稀释,N-cadherin、p-STAT3、Bax和GAPDH为1∶1 000稀释)在4 ℃下孵育过夜,然后与二抗(1∶3 000稀释)在室温下孵育1 h,化学发光试剂盒使蛋白条带显色。Image-ProPlus软件分析目的条带相对灰度值。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-519b-3p在宫颈癌组织中的表达

与癌旁组织比较,宫颈癌组织miR-519b-3p表达下调(P<0.05;图1)。

图1 宫颈癌组织和癌旁组织miR-519b-3p表达的比较a为P<0.05,与癌旁组织比较。

2.2 miR-519b-3p转染效率的检测

与转染miR-NC比较,转染miR-519b-3p模拟物后SiHa细胞miR-519b-3p表达显著升高(3.21±0.25比1.00±0.14;P<0.05),表明转染miR-519b-3p模拟物能够促进miR-519b-3p表达。

2.3 各组SiHa细胞凋亡率的比较

与miR-NC组比较,miR-519b-3p组SiHa细胞凋亡率升高,miR-NC+RhIL-6组细胞凋亡率降低;与miR-519b-3p组比较,miR-519b-3p+RhIL-6组细胞凋亡率降低(P<0.05;图2)。

图2 各组宫颈癌SiHa细胞凋亡率的比较1为miR-NC组;2为miR-519b-3p组;3为miR-NC+RhIL-6组;4为miR-519b-3p+RhIL-6组。a为P<0.05,与miR-NC组比较;b为P<0.05,与miR-519b-3p组比较。

2.4 各组SiHa细胞迁移、侵袭的比较

与miR-NC组比较,miR-519b-3p组SiHa细胞迁移数和侵袭数减少,miR-NC+RhIL-6组细胞迁移数和侵袭数增加;与miR-519b-3p组比较,miR-519b-3p+RhIL-6组细胞迁移数和侵袭数增加(P<0.05;图3)。

图3 各组宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭的比较(结晶紫染色,200×)1为miR-NC组;2为miR-519b-3p组;3为miR-NC+RhIL-6组;4为miR-519b-3p+RhIL-6组。a为P<0.05,与miR-NC组比较;b为P<0.05,与miR-519b-3p组比较。

2.5 各组SiHa细胞相关蛋白表达的比较

与miR-NC组比较,miR-519b-3p组Bax和E-cadherin蛋白水平升高,Bcl-2、N-cadherin、p-STAT3蛋白水平降低;miR-NC+RhIL-6组Bax和E-cadherin蛋白水平降低,Bcl-2、N-cadherin、p-STAT3蛋白水平升高(P<0.05);与miR-519b-3p组比较,miR-519b-3p+RhIL-6组Bax和E-cadherin蛋白水平降低,Bcl-2、N-cadherin、p-STAT3蛋白水平升高(P<0.05;图4)。

图4 各组宫颈癌SiHa细胞相关蛋白表达的比较1为miR-NC组;2为miR-519b-3p组;3为miR-NC+RhIL-6组;4为miR-519b-3p+RhIL-6组。a为P<0.05,与miR-NC组比较;b为P<0.05,与miR-519b-3p组比较。

3 讨 论

miRNA是具有调控作用的小RNA分子,其通过靶向下游信使RNA或调节多种信号途径影响细胞过程参与癌症进展,恢复肿瘤中抑癌miRNA水平或降低致癌miRNA水平是一种有前景的癌症替代治疗策略[9]。多项研究揭示了miR-519b-3p在结直肠癌中的作用,通过上调miR-519b-3p表达可增加结直肠癌细胞凋亡,抑制其侵袭和增殖,提高直肠癌细胞体外放化疗的反应性[10-12]。miR-519b-3p在喉癌组织中低表达,并通过下调COX-2蛋白水平抑制癌细胞生长[13]。此外,有报道发现,氧化槐果对宫颈癌细胞的凋亡诱导和迁移抑制作用可能与上调miR-519b-3p水平有关[14]。本研究发现,miR-519b-3p在宫颈癌组织中低表达,过表达miR-519b-3p导致SiHa细胞凋亡水平升高,迁移和侵袭能力降低,同时伴随着抗凋亡Bax蛋白水平上调和促凋亡Bcl-2蛋白水平下调,证实miR-519b-3p在宫颈癌中发挥凋亡促进和迁移侵袭抑制作用。EMT赋予癌细胞更强的迁移和侵袭能力,在此过程中上皮细胞转化为间充质细胞,上皮细胞标志物(如E-cadherin)表达减少,而间充质细胞标志物(如N-cadherin)表达增加[15]。为进一步揭示miR-519b-3p抗迁移和侵袭机制,本研究探讨miR-519b-3p在宫颈癌EMT中的功能发现,与细胞迁移和侵袭结果一致,过表达miR-519b-3p显著下调N-cadherin表达,上调E-cadherin表达。

IL-6家族在调控人类癌症的发生、进展和复发中发挥着重要作用,炎症细胞因子IL-6可激活STAT3调控细胞存活、转移和凋亡[16]。据报道,IL-6/STAT3通路组分的表达水平与肺癌患者的预后相关[17]。IL-6/STAT3信号通路通过靶向肿瘤干细胞介导肝癌对索拉非尼的耐药性[18]。敲除长链非编码RNA THOR可抑制IL-6/STAT3通路从而抑制卵巢癌细胞生长和转移[19]。另外,在宫颈癌中长链非编码-UICC通过激活IL-6/STAT3通路在体内和体外均能促进肿瘤生长和转移[20]。本研究发现,miR-519b-3p过表达导致SiHa细胞中p-STAT3水平降低,表明miR-519b-3p可抑制宫颈癌中IL-6/STAT3通路活化。RhIL-6处理可逆转miR-519b-3p诱导的p-STAT3水平降低,同时逆转miR-519b-3p过表达对SiHa细胞迁移、凋亡、侵袭和相关蛋白表达的影响,这提示miR-519b-3p通过抑制IL-6/STAT3通路进而抑制宫颈癌进展。

综上,本研究证实miR-519b-3p在宫颈癌组织中表达下调,过表达miR-519b-3p可通过抑制IL-6/STAT3通路来增加宫颈癌细胞凋亡并抑制其迁移和侵袭。这些发现有助于阐明宫颈癌进展和转移机制,并为其治疗提供新的理论依据。