下调HPV16 E6/E7 表达宫颈癌细胞Siha 上清液代谢组学

肖金宝，赵骏达，马俊旗

（新疆医科大学第一附属医院妇科门诊，新疆 乌鲁木齐 830000）

子宫颈癌（cervical cancer，CC）作为女性恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率持续上升且呈现低龄化，因而受到广泛关注[1]。宫颈癌恶性进展中主要是受到高危型人乳头瘤病毒HPV16、18 型的持续感染，导致癌基因E6 和E7 蛋白的活化，进而影响多条信号途径，促进癌细胞持续增殖，最终形成宫颈癌[2−3]。研究表明，E6 和E7 对葡萄糖[4−5]、脂肪酸[6]、氨基酸[7]代谢具有有一定的影响，宫颈癌细胞的增殖、转移离不开代谢产能的供给。因此，本研究探讨HPV E6/E7 蛋白的活化与宫颈癌相关能量代谢改变的关系，从而对宫颈癌的筛查、治疗、预后提供有利的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞人源宫颈癌Siha（HPV16+）细胞，购买于武汉Pricella 生命科技有限公司。

1.1.2 主要试剂HPV16 E6 抗体（sc-460）、HPV16 E7 ED17 抗体（sc-6981）购买于美国 Santa Cruz Biotechnology 公司。FBS 胎牛血清、青-链霉素、DMEM 培养基购买于BI 公司，X-tremeGENE™HP DNA 转染试剂盒购买于默克生命科学公司，每组质粒由海吉凯生物科技有限公司构建，RNAi 片段引物序列如下，见表1。

表1 E6 RNAi、E7 RNAi 片段引物序列Tab.1 Primer sequences of E6 RNAi and E7 RNAi fragments

1.2 实验方法

1.2.1 建立宫颈癌细胞Siha 的RNAi 载体转染siRNA 片段、对照（si-NON）构建于由吉凯基因科技有限公司（上海）。本实验根据默克公司生产的质粒转染试剂（名称：X-tremeGENE HP DNA）说明书，其官网http://www.powerful-transfection.com/尚写的详细操作实验步骤，首先调整Siha 细胞生长状态和所需的细胞数量进行试验。其次按照3 µL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent添加至1 µg 质粒DNA/100uL MEM 培养基中的比例进行转染。48 h 后应用莱卡荧光倒置显微镜（Leica DMIL LED）观察Siha 细胞转染效率，应用Western blot 验证。

1.2.2 细胞培养宫颈癌Siha 培养于DMEM 完全培养基，包含10%FBS 及2%PS，培养于37℃、5%的CO2培养箱内。

1.2.3 核磁共振检测细胞上清液-80℃冰箱中取出样品，准备在室温中4℃的冰水混合物中逐渐解冻，准备无酶EP 管，并加入450 µL 的每组细胞上清液，并加入DSS 缓冲溶液50 µl（配置比例：0.045MNaH2PO4+0.045MK2HPO4inD2O）。本实验中应用的实验仪器微波1HNMR，并采用NOESYPRESAT-ID 脉冲序列进行上清液内的氢谱测定，内标为DSS，将化学位移设定值为0 ppm。最后采用预饱和方式进一步抑制水峰，其时间设置为2 s，采样点数为32 k，谱宽需为10 000 Hz，扫描次数设为为126 次，采样时间平均1.64 s，测试温度为恒温（25℃）。

1.2.4 代谢谱数据分析方法所有1HNMR 谱需要经过相位和基线校正，并用增宽因子为0.5 Hz 的指数窗函数进行处理。数据用SIMCA-P+11 软件进行上清代谢数据的OPLS-DA 分析。各组细胞上清中差异性的代谢物需要经过OPLS-DA 分析，并确定从中得到其变量重要性的参数（variable importance in the projection，VIP）值，要求VIP＞1。

1.3 统计学处理

本文所涉及的实验结果均经过3 次独立实验的验证后取平均值。统计学分析采用SPSS17.0 软件。定量资料以（）表示，多组数据间的对比需采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E6-RNAi 和E7-RNAi 的细胞模型建立

通过荧光倒置显微镜对转染HPV16 编码E6或E7 基因序列特异性RNAi 片段的宫颈癌细胞进行观察，明确转染效果见图1A。Western blotting验证各组细胞E6/E7 蛋白表达量。结果显示，与Siha 组比较，si-E6 组与si-E7 组中E6/E7 的表达量降低（F=145.8，P＜0.001，图1B，图1C）。

图1 检测Siha 细胞内E6-RNAi 和E7-RNAi 的转染效率Fig.1 The transfection efficiency of E6-RNAi and E7-RNAi in Siha cells was detected

2.2 E6、E7 蛋白表达下调对宫颈癌细胞上清代谢谱变化的影响

利用1H-NMR 代谢谱分析细胞上清液，在si-E6、si-E7 组和Siha 组中共有差异代谢物13 种，见图2。异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸，酪氨酸，β-羟丁酸，苯丙氨酸，甲酸酪氨酸，α-葡萄糖，β-葡萄糖，乙酸，苯丙氨酸含量下降（P＜ 0.05）；乳酸，丙氨酸，甲酸含量上升（P＜ 0.05），见表2。

图2 RNA 干扰后SiHa 细胞上清1HNMR 谱图Fig.2 1HNMR spectra of SiHa suspention after RNAi

表2 RNA 干扰组与非干扰租1HNMR 谱经过OPLS-DA 分析获得的主要差异性代谢物及其相关系数Tab.2 Otherness metabolites of different cell samples using OPLS-DA based on different normalization methods and its correlation coefficients

2.3 E6、E7 蛋白表达下调对相关代谢通路的影响

利用MetaboAnalyst 5.0 在线软件分析，得到与13 种差异代谢物相关的变化10 条途径（P＜0.05），主要分为糖代谢与氨基酸代谢2 类。其中氨基酸代谢主要包含：（1）氨酰-tRNA 生物合成途径；（2）缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸生物化学代谢途径；（3）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物化学合成途径；（4）苯丙氨酸合成途径;（5）缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解途径；（6）苯丙氨酸的代谢途径；（7）酮体的合成与降解途径；（8）泛醌和其他萜类-醌类生物的合成途径。而糖代谢途径主要包括：（1）糖酵解/糖异生途径；（2）丙酮酸的代谢途径，乙醛酸和二羧酸类的代谢途径，见图3，表3。

图3 下调Siha 细胞E6/E7 蛋白代谢通路分析图Fig.3 Analysis of down-regulated E6/E7 protein metabolic pathways inSiha cells

表3 下调Siha 细胞E6/E7 蛋白后10 条相关代谢通路Tab.3 10 metabolic pathways associated with down-regulation of E6/E7 protein in SIHA cells

3 讨论

宫颈癌位居女性妇科恶性肿瘤第2 位，其不但威胁身心健康也会造成一定的经济负担。新疆地区高发肿瘤包括子宫颈癌，其发病率正呈现为年轻化[8−9]。宫颈癌诱发的主要原因是高危型的人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）2a 以上的持续性感染，其中常见于HPV16 和18 的感染[10]。其机制为HPV 的DNA 与宿主细胞的DNA整合，通过诱导致癌基因 E6、E7 和调控细胞周期得蛋白存在相互作用，紊乱细胞的周期，从而促进它无限增殖，演变为癌细胞[11]。

近年来，代谢重编程作为癌症标志之一，快速生长的癌细胞可以适应其不断增长的能量需求。癌细胞的是从缺乏营养的环境中获得必要的营养物质，并利用这些营养物质来维持细胞的活力、增殖。癌细胞的异常代谢功能最初是由奥托·瓦博格提出的，对于正常细胞而言，其肿瘤细胞偏向于消耗较多葡萄糖，提出“Warburg effect”[12−13]。自此，众多科学研究集中在与癌症相关其它类型的代谢重编程，如葡萄糖的氧化磷酸化、氨基酸合成和脂质氧化等代谢变化，为寻找癌症进展中其余的潜在的治疗靶点。课题组前期研究发现异常的糖代谢，脂代谢等会影响宫颈癌恶性进展[14−15]。

在宫颈癌进展中，参与糖酵解过程中关键酶如HK2 等呈现过表达，促进宫颈癌细胞的生长、转移等恶性行为[16]。研究显示，在肿瘤细胞中，抑制烯醇化酶1（enolase 1，ENO1）表达将抑制宫颈癌Hela 细胞发生典型上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）样形态学改变[17]。前期研究发现RACK1 通过IGF1R/Akt/mTOR 信号通路激活糖酵解途径促进宫颈癌发生淋巴结转移[18]。另1 个常见的代谢变化是氨基酸代谢增加，特别是谷氨酰胺代谢。谷氨酰胺是1 种主要的能量底物，为癌细胞提供额外的能量来源[19]。在肿瘤细胞中多种特定的氨基酸转运体均过表达，如钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2（sodiumdependent neutral amino acid transporter 2，SNAT2）、丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白2（alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2）溶、质载体家庭6成员14（solute carrier family 6 member 14，SLC6A14）等[20]。若靶向一些氨基酸的转运体，将会抑制其转运氨基酸，记忆布减弱其细胞捏ATP 能量代谢。

HPV 基因组转录本还含有非编码蛋白，通过蛋白质-蛋白质相互作用，在病毒与宿主的相互作用和感染的发展中发挥关键用途。E6/E7 直接促进糖酵解关键蛋白HK2 表达[21]，或HPV E6/p53 信号通路诱导的miR-34a/LDHA 轴调控宫颈癌Warburg 效应促进肿瘤的生长和侵袭[22]。故靶向HR-HPV 感染对抗糖酵解水平也可成为宫颈癌治疗的有效策略。研究显示，2 型转谷氨酰胺酶（transglutaminase 2，TG2）与宫颈癌细胞内HPV16-E6 蛋白的表达水平存在相关性，可作为早期识别的重要指标以及判断预后的重要的分子标记物[23]。本次研究通过下调Siha 细胞中E6、E7 蛋白后，利用1H-NMR 对转染后的细胞上清液进行代谢组学分析，筛选出13 种共有的并变化的差异代谢物，其中，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，酪氨酸，β-羟丁酸，苯丙氨酸，酪氨酸，α-葡萄糖，β-葡萄糖，乙酸，苯丙氨酸含量下降，乳酸，丙氨酸，甲酸含量上升。以上差异代谢物涉及10 条代谢通路，见图3 和表3。其主要影响氨基酸代谢以及葡萄糖代谢。提示E6/E7 的表达异常与氨基酸代谢和糖代谢紊乱存在相关性。

综上所述，HPV16 感染导致宫颈癌发生是一个复杂的过程，本研究结果表明，E6、E7 蛋白下调对葡萄糖代谢与氨基酸代谢相关的物质含量有影响，提示HPV16 感染与葡萄糖、氨基酸代谢改变之间存在着相互的关联，随着对E6/E7 蛋白诱导HPV 相关癌症的分子机制研究的不断深入，其可能会成为临床宫颈癌治疗的新靶点。本研究不足是缺少对E6、E7 影响葡萄糖、氨基酸代谢的调控机制的研究，后续实验将会继续探索其存在的主要调控机制。